基于网络药理学的防己黄芪汤防治2型糖尿病的潜在作用机制研究

陈璟 徐贝贝 徐坠成 单鑫 王威 许惠琴 吕志阳

摘   要：为了基于网络药理学方法研究防己黄芪汤防治2型糖尿病的潜在作用机制，采用中药系统药理学数据库及技术平台（TCMSP），按照口服生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18筛选处方中的活性成分及其相关靶点，通过Uniprot数据库找出对应官方基因名称。利用疾病靶点相关数据库检索与2型糖尿病相关的靶点基因。将活性成分所对应的靶点基因和2型糖尿病相关的靶点基因进行交集获得两者的共同基因即为防己黄芪汤治疗2型糖尿病的关键靶点。使用Cytoscape软件构建中药-活性成分-关键靶点网络，根据度值进行筛选，寻找该方剂防治2型糖尿病的主要物质基础。利用DAVID数据库及ClueGo插件对关键作用靶点进行GO注释分析和KEGG通路分析，从而探究防己黄芪汤干预2型糖尿病的生物过程及作用通路。结果显示，筛选得到防己黄芪汤122个活性成分及242个潜在作用靶点，其中，与2型糖尿病重复的83个关键靶点中STAT3，AKT1，TNF，JUN，TP53，MAPK14，MAPK1，MAPK8可能通过调控AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路、FoXO信号通路发挥治疗作用。由此得出结论：通过网络药理学预测防己黄芪汤防治2型糖尿病的关键靶点及其相关信号通路，推测该方剂对2型糖尿病的潜在作用机制，大都和脂代谢的过程、氧化应激过程相关，为进一步阐明防己黄芪汤对2型糖尿病的作用机制提供了科学依据。

关键词：防己黄芪汤;2型糖尿病;网络药理学;潜在靶点

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）为临床上常见的一种代谢紊乱性疾病，在全球范围内严重威胁人类身体健康[1]，其患者以长期高血糖为主要特征，严重时通常伴有如心血管疾病、肾病、眼底病变等多种并发症。其中，2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM ）占糖尿病患者90%以上[2]，陈思兰等发现其发病与胰岛素抵抗（Insulin-Resistance，IR）密不可分，因胰岛素抵抗导致患者胰岛素分泌相对不足。西医治疗多通过控制患者饮食或使用降糖藥物来保证治疗效果[3]，然而长期服用容易产生许多副作用，降低疗效。为了寻找能够防治2型糖尿病的有效药物，本研究将目光放到传统的中医药上。中医药在防治DM方面历史悠久，积累了大量的宝贵临床经验，近年来文献报道屡见不鲜。

DM属中医消渴病范畴，中医认为IR的发生为脾失健运、肝失疏泄、肾阳不化等脏腑功能失调所致[4]。张景岳在《景岳全书·痰饮》中说：“五脏之病，虽皆能生痰，然无不由于脾肾。”脾肾虚损导致机体津液代谢异常，痰湿困脾，阻滞机体组织间物质交换，影响胰岛素和葡萄糖、脂质、蛋白等水谷精微代谢，表现为痰浊、血瘀，二者互相影响，共同加重IR程度。由此可见，可以通过改善IR来治疗T2DM，从中医辩证角度出发，采用一些活血化瘀、理气化痰、滋阴补肾的中药复方，将会在治疗T2DM上大有成效。据《金匮要略》记载，防己黄芪汤（FJHQT）具有补气健脾、祛风除湿、利水消肿之功效。防己黄芪二者配伍，祛风利湿不伤表，固表止汗不留邪，白术作为臣药健脾利湿，甘草又调和诸药，使其相得益彰[5]。研究表明[6-9]，FJHQT确有调血脂、降血糖、减肥的功效。贾真等[10]通过大鼠实验发现防己黄芪汤可以提高高脂饲养大鼠的胰岛素敏感性，改善脂质代谢紊乱。目前，FJHQT中各单味药的化学成分虽有报道，但鉴于中药成分复杂而DM又是多基因、多靶点作用的疾病，对该方剂防治T2DM仍缺乏系统的研究。

网络药理学通过不同层次的网络构建系统地揭示药物作用靶点与疾病靶点之间的关系，从微观层面观察复杂药物对多靶点疾病的干预和影响。本研究拟通过网络药理学的方法筛选FJHQT中各单味药的活性成分及作用靶点，检索已知的T2DM的相关靶点，利用DAVID数据库及ClueGo分析探究防己黄芪汤干预2型糖尿病的潜在作用通路，为临床治疗T2DM提供新思路。

1    材料与方法

1.1  FJHQT处方中各单味药活性成分的筛选

通过查询《中国药典2015版》所得防己黄芪汤处方中4味药分别是：防己、黄芪、白术、甘草。采用中药系统药理学数据库及技术平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）筛选防己、黄芪、白术、甘草4味药中的活性成分。TCMSP包括：《中国药典2015版》含有的400多种中药材，800多个相关疾病的基因，3 000多个靶点基因和20 000多种活性成分，TCMSP作为可靠的中草药信息数据平台，为广大学者搜集中药复方所含成分及其相关作用靶点等相关化学信息提供了便利。研究人员可通过设置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）、类药性（Drug Likeness，DL）等ADME参数获取自己想要的有效信息。FJHQT作为汤剂，临床上通常以口服方式给药，故按照口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18进行筛选得到FJHQT中的活性成分，记录其相关靶点蛋白名和在其他文献中收集到的关于FJHQT的重要成分及其相关靶点蛋白名于Excel表格中。

1.2  处方中潜在作用靶点预测及构建“药物活性成分-潜在作用靶点”网络关系

Uniprot，全称Universal Protein，是目前信息最丰富、资源最广的免费蛋白质数据库，使用者可通过其中的关键词搜索到感兴趣的蛋白名称。由上述TCMSP搜索得到活性成分及其相关靶点蛋白名，将药物相关靶点蛋白名通过Uniprot数据库中的Uniprot KB搜索区找出对应的官方基因名（Gene Symbol），筛选物种为人类的靶点基因名称。将4味药的基因名导入到Excel表格，删除重复项得到全方的潜在作用靶点。用Cytoscape3.7.0软件构建“药物活性成分-潜在作用靶点”网络图，其中节点代表药物化学成分和相应的作用靶点，节点的度值（Degree）表示药物活性成分与作用靶点连线的条数，通过度值筛选可以得到与药物活性成分高度连接的蛋白，这些蛋白在网络中的作用不可忽视。

1.3  T2DM靶点的收集

检索GeneCards数据库（http：//www.genecards.org/）和人类在线孟德尔遗传平台（http：//www.omim.org/）等与疾病靶点相关的数据库，以“Type 2 diabetes Mellitus”为关键词搜索与2型糖尿病相关的已知靶点并删除重复项进行整合。

1.4  关键作用靶点的获取

将药物潜在作用靶点与疾病相关靶点通过omicshare平台（https：//www.omicshare.com/）绘制维恩图，从而得到防己黄芪汤治疗T2DM的关键作用靶点，为后续构建蛋白互作网络图提供依据。

1.5  关键作用靶点的GO注释及KEGG通路富集

利用DAVID数据库对关键作用靶点进行GO注释分析，将筛选条件设置为细胞的组成（cellular component），分子的功能（molecular function）和生物的过程（biological process）3个筛选条件，最后再点击Functional Annotation Table，得到GO注释结果。利用Cytoscape3.7.0软件中的ClueGo插件对关键作用靶点进行KEGG通路分析，将关键作用靶点输入到GENES一栏，选择物种为人类，再设定P<0.05，选择KEGG通路，最后点击start开始分析，得到防己黄芪汤干预2型糖尿病的潜在作用通路。

2    实验过程分析

2.1  FJHQT活性成分及相关靶点信息

利用TCMSP数据库查询到防己的化学成分50个，黄芪的化学成分87个，白术的化学成分55个，甘草的化学成分280个，共计472个化学成分。经OB、DL等药代动力学（ADME）参数筛选得到防己的活性成分3个，黄芪的活性成分20个，白术的活性成分7个，甘草的活性成分92个，共计122个活性成分，将其相关靶点蛋白名记录于Excel表格中。

2.2  FJHQT潜在作用靶点预测结果及“活性成分-潜在作用靶点”网络分析

对上述122个活性成分进行潜在作用靶点预测并进行靶点基因名称的修正，通过TCMSP数据库收集122个活性成分的潜在作用靶点，打开Uniprot（http：//www.uniprot.org/）数据库，选择Uniprot KB搜索区，将潜在作用靶点的蛋白名键入得到对应的官方基因名，剔除非人源靶点。将活性成分、相关靶点蛋白名、官方基因名3列数据统计于Excel表格中，删除重复项得到1 994条对应关系。将官方基因名单独列出去后得到FJHQT的潜在作用靶点242个。将122个活性成分及242个潜在作用靶点导入Cytoscape3.7.0 软件进行可视化构建“活性成分-潜在作用靶点”网络，揭示药物成分与靶点之间的关系。按度值筛选排名前20的有槲皮素（Quercetin），PTGS2，ESR1，CALM1，HSP90AB1，NOS2，AR，PPARG，山奈酚（kaempferol），PAL_GLEAN10007028，PRSS1，GSK3B，CDK2，ESR2，CCNA2，F10，NCOA2，SCN5A，MAPK14，CHEK1。

2.3  T2DM相关靶点信息

通过人类在线孟德尔遗传平台OMIM检索到T2DM相关靶点31个，通过Genecards数据库检索到T2DM相关靶点408个，共计439个相关靶点。

2.4  关键作用靶点的生物功能预测及作用通路分析

通过DAVID数据库对上述关键作用靶点进行GO注释分析，根据错误分析率（FDR）<0.05筛选得到20条GO条目（见图1），其中，大多数关于生物学的过程主要涉及：内皮细胞凋亡过程的调控、DNA转录的调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调节、MHC Ⅱ类生物合成过程的调节、肽基丝氨酸磷酸化过程、脂多糖介导信号通路等。关于分子功能主要涉及细胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、MAP激酶活性。此外，有的条目还显示与炎症反应、血管生成有关。GO注释分析结果如图1所示。通过Cytoscape3.7.0 软件中的ClueGo插件对关键靶点进行KEGG通路富集分析，其中P<0.05的通路有11条被显著富集（见图2），分别是：AGE-RAGE信号通路、AMPK信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体通路、松弛素信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、胰岛素信号通路、鞘脂信号通路、FoXO信号通路，表示FJHQT可能通过这些通路起到防治T2DM的作用，應予以重点关注。

3    实验结果分析

现阶段，我国糖尿病患者已经有9 000多万人，而其中2型糖尿病居多，2型糖尿病是一种慢性代谢功能障碍，其特征在于进行性胰岛素抵抗和高血糖症。现代分子学研究表明，不同信号通路及其相关蛋白、基因参与调控该疾病的发生与发展，相互作用机制复杂，单纯通过使用降血糖、降血压、改善微循环等“点对点”的药物干预方式，很难推动糖尿病治疗进展，临床效果较差。中药复方成分复杂，其多靶点的协同作用值得引起注意，防己黄芪汤在临床治疗消渴症包括一些糖尿病并发症方面的疗效确切，但是中药复方治疗T2DM的作用机制尚不清晰。网络药理学突破单靶点的研究模式，从多靶点研究思路出发，为探索中药复方的疗效提供新思路。本研究采用了网络药理学研究思路，初步挖掘、分析防己黄芪汤多靶点防治T2DM可能的作用机制。

本研究采用网络药理学的研究方法对防己黄芪汤进行研究，最后得到防己黄芪汤122个入血活性成分，预测了242个潜在作用靶点。其中槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）等活性成分可作用于多个靶点。槲皮素属于植物类黄酮并且在体外具有有效的抗氧化特性，最近的文献报道槲皮素可能在体内具有抗癌和抗炎功能，与此同时，槲皮素还可以预防糖尿病并发症的发生[10]，山奈酚可用作治疗糖尿病肾病的潜在治疗剂。在对靶点的预测过程中，发现CALM1、PTGS2等靶点可作用于多个潜在活性成分，这表现出了中药多个成分共同作用的特征。在GO富集分析结果中，发现主要涉及：内皮细胞凋亡过程的调控、DNA转录的调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调节、MHC Ⅱ类生物合成过程的调节、肽基丝氨酸磷酸化过程、脂多糖介导信号通路等。在KEGG通路分析结果中，发现预测的关键靶点主要集中作用在AGE-RAGE信号通路、AMPK信号通路、VEGF信号通路。这些通路主要在氧化应激、炎症、脂质代谢等方面具有良好的作用，并且上述通路与目前相关研究结果具有一致性，证明本研究预测出的结果具有可靠性。

4    结语

通过网络药理学预测防己黄芪汤防治2型糖尿病的关键作用靶点及其相关信号通路，推测防己黄芪汤对2型糖尿病的潜在作用机制，推测结果可能主要是：内皮细胞凋亡过程的调控、DNA转录的调节、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的调节等。关于分子功能主要涉及细胞因子活性等。此外，有的条目还显示与炎症反应、血管生成有关，为阐明防己黄芪汤对2型糖尿病的作用机制提供了科学依据，但还存在一些缺陷，主要是未对预测获得的活性成分、关键靶点和有关通路进行实验验证。为了进一步探讨其复杂的过程和作用机制，将会结合上述结果进行更深入的实验研究。

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