HPLC 指纹图谱评价何首乌和制何首乌不同提取部位肝毒性

许晓丽任 晶翟文泽罗 兰王淑美梁生旺陈 超

（1.广东药科大学，广东 广州510006； 2.国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东广州510006； 3.广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州510006； 4.广东省中药质量工程技术研究中心，广东 广州510006）

毒理学研究表明，何首乌在正常动物水平需要在超大剂量（40～60 g／kg）、长期给药（4～12 周）情况下才能引起大鼠肝损伤，与一般意义上的肝毒物明显不同［1-5］；Chang 等［6］根据国家不良反应中心的数据，以及302 医院药物性肝损伤临床数据库的统计，推测何首乌肝损伤的总体发病率较低，可能存在高危人群，并且其在正常动物安全性评价表现出了肝毒性不强的特点［7-8］，因此考虑何首乌肝损伤可能类似于特异质肝损伤。微量的脂多糖（LPS）可以引起温和无损伤的炎症反应，而不会发展为明显的肝细胞毒性；但是伴随着炎症因子的释放，破坏组织内环境平衡，导致肝脏对药物的敏感性大大增强，表现出药物特异质肝损伤。基于LPS 模型评价药物的特异质肝损伤已有较多文献报道［9-10］。

2015 年版《中国药典》 一部中共有乙肝宁颗粒、乙肝宁颗粒乙肝养阴活血颗粒、七宝美髯颗粒等59 例成方制剂和单味制剂配方中含有何首乌或制何首乌［5］。这59 例成方制剂和单味制剂在制备过程中，制首乌主要用到的提取溶剂有水及30%、50%、60%、65%、70%、75%、80% 乙醇；何首乌主要的提取溶剂有水、70% 乙醇、50% 乙醇。文献研究［11］表明，在内毒素特异质模型上，生首乌1.08 g／kg剂量（相当于生首乌6 g／d 临床剂量的2 倍等效剂量）可造成实验大鼠肝功能损伤，制首乌8.64 g／kg 剂量（相当于制首乌12 g／kg 临床剂量的8 倍等效剂量）对实验大鼠肝功能造成损伤。本研究选用给药量为生首乌3.24 g／kg（相当于生首乌6 g／d 临床剂量的6 倍等效剂量），制何首乌12.96 g／kg（相当于制首乌12 g／d 临床剂量的12 倍等效剂量），采用基于内毒素（脂多糖）的特异质肝损伤动物模型，以大鼠ALT、AST 水平为评价指标，对生首乌和制何首乌水、50% 乙醇、75% 乙醇3 个提取部位特异质肝损伤进行评价研究。

1 材料

1.1 动物 雄性SD 大鼠，SPF 级，鼠龄6～7 周，体质量（180±20）g，购于广东省实验动物中心［合格证号SYXK（粤）2012-0125］，分笼饲养，置于室温（25±2）℃、相对湿度50%～60%的SPF 级屏蔽环境中，通风良好，环境安静，给予灭菌动物维持饲料及饮用水，自由饮食，并定期用紫外灯光消毒。

1.2 试剂与药物 何首乌饮片（采集于广东省肇庆市德钦县，加工于广州健泽药业有限公司）；制何首乌饮片（批号160627，广州健泽药业有限公司）。水合氯醛（批号20160606，天津市大茂化学试剂厂）；L2880 脂多糖（德国Sigma 公司）；0.9%氯化钠液注射液（批号B16040503，山东华鲁制药有限公司）。肝素钠一次性真空采血管（浏阳市三力医用科技发展有限公司）；一次性真空采血针（产品标准号YZB／国0411-2015，浏阳市三力医用科技发展有限公司）；一次性无菌注射器（浙江欧健医用器材有限公司）。流动相（甲醇）为欧普森色谱纯；乙醇为分析纯；H3PO4为色谱纯；水为超纯水。

1.3 仪器 SIGMA2-16KL 低温离心机（德国Sigma 公司）；7180 型全自动生化分析仪（日本日立株式会社）；E2695高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；BP211D 型Sartorius AG 电子天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；KQ-500E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；WP-UPWF-10 超纯水机（四川沃特尔水设备处理有限公司）；YP502N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 样品制备 取饮片适量，粉碎，取适量粉末，加10倍量的提取溶剂，加热回流1 h，共提取2 次，趁热过滤，合并滤液，减压浓缩回收尽乙醇，临用前用蒸馏水配制成相应浓度（按可比生药量计算），给药量为生首乌3.24 g／kg（相当于生首乌6 g／d 临床剂量的6 倍等效剂量）、制何首乌12.96 g／kg（相当于生首乌12 g／d 临床剂量的12 倍等效剂量）。

2.2 HPLC 指纹峰总面积测定

2.2.1 色谱条件 AQ-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～20 min，15%～30%A；20～35 min，30%～40%A；35～55 min，40%～75% A；55～75 min，75%～100% A）；体积流量0.8 mL／min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长270 nm，记录75 min。理论塔板数按2，3，5，4′-四羟基反式二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰计算应不低于2 000。

2.2.2 供试品溶液制备 取2.1”项下生首乌3 个提取部位（50%乙醇、75%乙醇、水）药液，加入适量甲醇稀释至20 mg／mL；另取制何首乌3 个提取部位（50% 乙醇、75%乙醇、水）药液，加入适量甲醇稀释至40 mg／mL，即得。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液（50% 乙醇-生首乌），在“2.2.1”项色谱条件下进样6 次。测得信噪比（S／N）大于10 的指纹峰总面积RSD＜3.0%，表明该仪器精密度良好。

2.2.3.2 稳定性试验 取同一供试品溶液（50% 乙醇-生首乌），分别于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样，测得信噪比（S／N）大于10 的指纹峰总面积RSD＜3.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.3.3 重复性试验 平行制备生首乌饮片50%乙醇提取部位溶液5 份，在“2.2.1”项色谱条件下进样，测得信噪比（S／N）大于10 的指纹峰总面积RSD＜3.0%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 样品测定 精密吸取供试品溶液10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样，得到不同提取部位的指纹峰峰面积，指纹图谱见图1，生首乌和制首乌3 个提取部位信噪比（S／N）大于10 的指纹峰总面积见表1。

表1 不同溶剂提取部位信噪比大于10 的指纹峰总面积（n＝2）

图1 生、制何首乌不同提取溶剂部位HPLC 指纹图谱

2.3 特异质肝损伤评价

2.3.1 动物分组 将140 只SD 大鼠随机分为14 组（n＝10）：空白组（组1）；模型组（组2）；单独给药组，包括50%乙醇-生首乌（组3），75%乙醇-生首乌（组4），水-生首乌（组5），50%乙醇-制首乌（组6），75%乙醇-制首乌（组7），水-制首乌（组8）；LPS 联合给药组，包括50%乙醇-生首乌（组9），75%乙醇-生首乌（组10），水-生首乌（组11），50% 乙醇-制首乌（组12），75% 乙醇-制首乌（组13），水-制首乌（组14）。

2.3.2 给药方式 大鼠禁食不禁水12 h 后，称定体质量，单独给药组及LPS 联合给药组均灌胃给予不同提取部位药液，空白组和LPS 模型组均灌胃给予等量蒸馏水，给药1次，3 h 后LPS 模型组及LPS 联合给药组大鼠尾静脉注射给予无毒剂量（2.8 mg／kg）LPS［12-13］。

2.3.3 标本采集 大鼠尾静脉注射给予LPS 7 h 后，采用10% 水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，3 500 r／min 离心10 min，取血浆。

2.3.4 血浆指标检测 采用7180 型全自动生化分析仪检测肝功能指标，包括谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT）。

3 结果

3.1 一般情况观察 单独给药组（组3～8）大鼠0.5～2 h内均出现轻微腹泻现象，尿液颜色加深；水提物组（组5、8）轻于醇提物组（组3、4、6、7）；尾静脉注射脂多糖（LPS）后，LPS 模型组和LPS 联合组（组9～14）在0.5～2 h 均出现排便量增多的现象，LPS 联合生首乌和制首乌醇提物组（组9、10、12、13）重于LPS 联合生首乌和制首乌水提物组（组11、14）。LPS 联合给药组中，生首乌和制首乌醇提物组（组9、10、12、13）大鼠大便稀溏、臭味重，精神呆滞，出现怠动、无力等症状；生首乌和制首乌水提物组（组11、14）也出现精神萎靡、便溏等症状，但相比醇提物组症状较轻。

3.2 对大鼠血浆ALT、AST 水平的影响

分别以空白组和模型组为参照，将各单独给药组及LPS 联合各给药组的ALT、AST 水平进行两独立样本的非参数检验。各组测得值见表2，方差分析见表3。

表2 各组ALT、AST 水平（）

表2 各组ALT、AST 水平（）

表3 方差分析

与空白组比较，模型组大鼠的AST、ALT 水平差异无统计学意义（P＞0.05），表明造模成功，可用于特异质肝损伤评价。与空白组或模型组比较，单独灌胃给药生首乌和制何首乌组均对两者差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组或模型组比较，LPS 联合生首乌不同提取部位组及制何首乌不同提取部位组均对两者差异有统计学意义（P＜0.05）。

P1值为LPS 联合给药组各组ALT 水平，P2值为LPS联合给药组各组AST 水平，以P1、P2值为参考指标，两者权重均为0.5，进行加权综合评分，评价LPS 联合给药组不同组别间肝毒性大小，得分越高表明肝损伤越严重。P值隶属度＝（指标值-指标最小值）／（指标最大值-指标最小值）。LPS 联合生首乌不同部位，组9～11，结果见表4；LPS 联合制首乌不同部位，组12～14，结果见表5。

表4 LPS 联合生首乌不同部位的各组综合评分

表5 LPS 联合制首乌不同部位的各组综合评分

4 讨论

表1 表明，生首乌和制首乌3 个提取部位信噪比（S／N）大于10 指纹峰总面积由大到小依次为50% 乙醇、75%乙醇、水。表4～5 表明，LPS 联合生首乌不同部位给药组中各组肝损伤严重程度由重到轻依次为LPS＋50%乙醇-生首乌、LPS＋75% 乙醇-生首乌、LPS＋水-生首乌；LPS 联合制首乌不同部位给药组中各组肝损伤严重程度由重到轻依次为LPS＋50%乙醇-制首乌、LPS＋75%乙醇-制首乌、LPS＋水-制首乌。

相关研究推测，大黄素、大黄素甲醚、大黄素结合蒽醌、大黄素甲醚结合蒽醌为毒性关联成分［14-15］；也有研究认为，何首乌肝损伤是二苯乙烯苷和大黄素协同作用的结果，并有课题组提出“中药（何首乌）免疫应激肝损害假说”［16］。中药饮片成分复杂，其发挥功效具有多成分、多靶点协同作用的特点，HPLC 指纹图谱能够反应多成分信息，可以更科学、更全面的反映样品化学成分特征。有研究比较了不同溶剂提取何首乌对肝细胞毒性的差异［17］，发现50%乙醇提取物毒性最强，与前期所得50%提取部位毒性最大、HPLC 总峰面积也最大的结论相符，因此该部位能更好的体现毒性成分信息，但具体是哪类物质尚不明确，还有待进一步研究。