精子DNA 碎片与复发性流产相关性的系统评价*

濮义福 卢少明

山东大学附属生殖医院（山东济南 250000）

复发性流产影响1%～2%的夫妇，定义为妊娠20 周前连续流产次数≥3 次[1]。 关于复发性流产的定义国内外并不完全统一。 复发性流产的病因复杂，超过一半的病因仍然无法解释[2]。 近期关于男性因素在复发性流产研究上有一些报告[3，4]。 如精液常规分析，但应该注意的是，常规精液分析只显示有关精子浓度，运动和形态等方面，并没有提供有关精子生育潜力的方面[5]，针对这一方面， 研究人员研究了男性精子非整倍体率、 精子DNA 碎片和精子染色质浓聚等方面，显然，精子DNA碎片指数的研究是必要的[6]。 精子DNA 碎片已成为男性不育症诊断的生物标志物，且有不同测定方法。 因为各个研究间存在一些差异，包括使用不同的检测方法、不完全统一的研究对象、 不同阈值以及复发性流产的定义，得出的结论不相统一，进行的meta 分析（异质性大，纳入的研究为前瞻性研究，纳入的研究为为英语发表的文献，研究数量有限）证据不足，因此有必要进行系统评价，探究精子DNA 碎片与复发性流产的相关性。

资料和方法

一、文献检索

在MEDLINE，EMBASE，Web of Science 和Cochrane 图书馆数据库进行了搜索， 从建库到2019 年7 月10 日， 应用以下术 语：“Sperm DNA integrity”, “The sperm DNA integrity ”, “sperm DNA fragmentation index”, “sperm DNA fragmentation”, “SDF”, “DFI”, “Habitual Abortion”, “Habitual Abortions”, “M iscarriage,Recurrent”, “Recurrent M iscarriage”, “Recurrent M iscarriages”, “Abortion, Recurrent”, “Recurrent Abortion”,“Recurrent Abortions”,“Recurrent Early Pregnancy Loss”,“recurrent spontaneous abortion”。

二、文献筛选

两位作者根据纳入和排除标准确定并选择了这些文章。 纳入标准如下：（1）配偶为复发性流产者的不育男性（没有其他特殊情况）和研究结果为精子DNA 碎片/DNA 完整性; 复发性流产的定义包括在妊娠早中期（＜24 周）≥2 次或3 次，并且对照组是配偶无复发性流产史正常生育能力的男性（没有其他特殊情况;捐精者也被考虑符合要求）; （2）有足够充分的数据; （3）对研究类型没有限制; （4）精子DNA 碎片指数的测定方法为AO，Comet，SCSA，SCD，TUNEL. 排除标准如下：（1）非复发性流产者;（2）研究非精子DNA 碎片。 （3）应用其他的测定方法的；（4）其他语言文献。

三、资料提取

两名作者独立进行数据统计， 意见不一致时通过讨论和向专家咨询解决。 如有必要， 联系第一作者或相应作者以获取更多信息。

四、质量评价

根据纽卡斯尔- 渥太华质量评估量表（NOS）对该系统综述中的文献进行严格评估[7]，此量表为Cochrane工作组推荐的有效工具， 用于评估非随机研究偏倚的风险。 对于横断面研究，使用了改进的NOS 量表（由Barry 等人提出）[8]。 根据NOS 得分， 研究分为低质量（0-3 分），中等质量（4-6 分）和高质量（7-9 分） 。 两位作者独立进行了质量评估。 达成共识以解决分歧。

五、统计学分析

本文前期行meta 分析及已发表的meta 分析均示异质性大，通过定量的分析具有明显的偏倚，meta 分析结果的可靠性较低，遂虽有具体的数据，因为异质性大的问题，行定性的分析即依据有效文献的研究质量，通过对每篇有效文献的结论进行总结， 判断当前的有效文献结论是否多数一致， 因此具体的统计学分析方法就是通过定性的方式。

结 果

一、文献检索结果

检索过程见流程图1。 共搜到242 篇文章。 在基于先前纳入标准及题目摘要筛选之后，确定了54 篇文章用于全文筛选。 在进一步筛查中，8 篇因涉及到不相关结果被排除;6 篇为系统综述被排除;6 篇为非复发性流产被排除;5 篇因非精子DNA 碎片被排除，1 篇因信息不完整被排除。 最终，本综述纳入了28 篇研究，其中中文文献3 篇，英文文献25 篇。

图1 文献的筛选及纳入流程图

二、纳入研究基本特征

提取的信息来自符合条件的28 篇文献[9-36]，内容包括作者/时间；研究组与对照组人数；研究地点；复发性流产的定义；精子DNA 碎片指数的测量方法等。 研究共包括1981 个参与者， 根据精子DNA 碎片的测量方法（Comet，AO，TUNEL，SCSA，SCD）对研究进行分类。详细信息见表1。

表1 纳入研究基本特征

三、纳入文献的质量评价

根据质量评价标准， 纳入的文献中14 篇为高质量，14 篇为中等质量， 无低质量研究。 详细的内容见表2。

表2 纳入非随机对照研究的质量评价表

1.以AO 法测定精子DNA 碎片

因不同的结果指标、不完全统一的研究对象、研究设计包括方法等的不同，总共四篇定性分析研究。 结果表明RSA 组与对照组相比，精子DNA 完整性低，精子DNA 碎片指数高。 研究（Kazerooni T2009）用AO 方法测定的精子染色质质量， 即用精子染色质水平代替精子DNA 水平，虽然结果显示两组间没有差异，但是从精子DNA 水平结果是有待进一步验证的。 因此，可以认为AO 方法的研究结果表明，与对照组相比，RSA 组患者的精子DNA 碎片指数更高， 复发性流产与精子DNA 碎片是相关的。 详细信息见表3。

表3 RSA 组与对照组以AO 法测定精子DNA 碎片指数结论比较

2.以Comet 测定精子DNA 碎片指数

定性分析两篇研究，结果表明与对照组相比，RSA组患者的DFI 更高。 因Comet 的测定方法不统一，研究（Shamsi MB2011）为Grade C and Grade D Comet，而(Ribas-Maynou J2012)用的是Alkaline Comet 和Neutral Comet，但是无论用何种方式，两篇研究均得到一致的观点。 详细信息见表4。

3.以TUNEL 法测定精子DNA 碎片指数

8 篇研究通过定性分析， 其中6 篇研究表明，RSA组患者DFI 高于对照组。 另外两篇研究（CoughlanC2015）和（CamilleEsquerré-Lamare2018）表明两组之间没有显着差异。 研究（Coughlan C2015）有一些局限性，最值得注意的是，对于精子DNA 碎片检查的精子不是来自导致受孕的精液， 而是来自以后为研究目的而产生的标本。 因此，精子DNA 碎片指数可能会随着时间的推移而发生变化。 此外， 它进行了两次精子DNA 碎片检测，且研究中的各组基线特征存在异质性，从 而 影 响 结 果 的 可 信 度。 研 究（CamilleEsquerré-Lamare2018）进行了一项多中心前瞻性病例对照研究，样本量较小，纳入标准较宽，这可能会导致患者偏倚，且测量方法为多个， 在选材及制作样本的过程可能还存在选择偏倚。 因此，两篇研究的结果均有待进一步验证。总之，目前通过TUNEL 方法测定的研究表明，与对照组相比，RSA 患者的DFI 高。 详细信息见表5。

表4 RSA 组与对照组以Comet 法测定精子DNA 碎片指数结论比较

表5 RSA 组与对照组以TUNEL 法测定精子DNA 碎片指数结论比较

4.以SCSA 法测定精子DNA 碎片指数

9 篇研究通过定性分析， 其中7 项研究结果表明，RSA 组患者DFI 高于对照组。 另外两项研究（Gil-Villa AM 2010 和Cam illeEsquerré-Lamare2018）表明两组之间没有显着差异。 研究（Gil-VillaAM 2010）中，两组年龄有统计学差异， 年龄可能有助于改变精子DNA 碎片。 研究（Cam illeEsquerré-Lamare2018）理由同上三（TUNEL）。 总之，SCSA 测定的研究表明，与对照组相比，RSA 患者的DFI 高于对照组。 详细信息见表6。

5.以SCD 法测定精子DNA 碎片指数

9 篇研究通过定性分析，其中8 篇研究表明，与对照 组 相 比，RSA 组 患 者 的DFI 高。 研 究（CoughlanC2015）理由同上三（TUNEL）。 总之，SCD 测定的结果表明DFI 在RSA 组中高。 详细信息见表7。

表6 RSA 组与对照组以SCSA 法测定精子DNA 碎片指数结论比较

表7 RSA 组与对照组以SCD 法测定精子DNA 碎片指数结论比较

讨 论

在这篇系统评价中，有4 篇研究(Kazerooni T2009、Gil-Villa AM 2010、CoughlanC2015、Camille Esquerré-Lamare2018） 报告两组在精子DNA 碎片方面没有差异，其他研究均支持RSA 组的精子DFI%增加或DNA完整性%降低。研究（Kazerooni T2009）用AO 方法测定的精子染色质质量， 即用精子染色质水平代替精子DNA 水平，虽然结果显示两组间没有差异，但是从精子DNA 水平结果是有待进一步验证的。 研究（Gil-VillaAM 2010）中，两组年龄有统计学差异，随者年龄变化精子DNA 碎片指数也是变化的。 研究（Coughlan C2015）是存在明显的局限性，尤其是对于精子DNA 碎片检查的精子不是来自导致受孕的精液， 而是来自以后为研究目的而产生的标本。 因此，精子DNA 碎片指数可能会随着时间的推移而发生变化。 此外，它进行了两次精子DNA 碎片检测，且研究中的各组基线特征存在异质性，从而影响结果的可信度。 研究（Camille Esquerré-Lamare2018）进行了一项多中心前瞻性病例对照研究，样本量较小，纳入标准较宽，这可能会导致患者偏倚，且测量方法为多个，在选材及制作样本的过程可能还存在选择偏倚。 纳入的所有有效文献的汇总分析与各个具体方法（Acridine orange test（AO）、Comet assay（Comet）、Sperm Chromatin Structure assay （SCSA）、Sperm Chromatin Dispersion （SCD）、The term inal deoxyuridine nick labeling assay（TUNEL））得出的结论是一致的，均支持复发性流产患者配偶精子DNA 碎片指数是高于配偶无复发性流产史的正常生育男性。

对RPL 夫妇， 精子DNA 碎片增加的具体机制尚不明确。多数认为与氧化应激、精索静脉曲张、年龄[37]等方面有关。 现在多数研究表明氧化应激（ROS）是精子DNA 碎片产生的主要原因[38-39]。 值得注意的是，生理条件下精子需要少量的ROS 来调节正常功能，包括精子活力， 顶体反应和受精。 ROS 和抗氧化剂之间的平衡对于防止过量的ROS 产生至关重要[40]。因此，DFI，ROS水平可被视为复发性流产治疗中的有价值参数。 另一方面， 有证据表明含有DNA 碎片的精子可以存活，运动，并具有正常的形态，甚至可以使卵母细胞受精。 精子DNA 损伤如果不修复，就会导致生育能力下降。 但是，卵母细胞能够修复精子DNA，其程度取决于卵母细胞的质量和精子DNA 损伤的程度，未能修复就会导致多种问题，包括复发性流产[41-42]。 迄今为止，一些研究证实， 抗氧化治疗可能是提高精子参数和提高精子DNA质量的有效方法[43]。抗氧化治疗可能有助于有复发性流产病史的夫妇。 目前的指南并不建议男性伴侣精子DNA 碎片的常规诊断筛查。在RSA 夫妇中男性因素研究较少，局限于染色体核型，精子功能的评估在很大程度上被忽视[44]。 此外，关于精子DNA 碎片指数的测定方法，基于不同的原理，不同的过程，值得注意的是SCSA 与AO 虽然是基于相同的原理， 但是检测精子DNA碎片的过程是不一致的，如检测的精子数；新鲜精子或冷冻精子；手动计数或流式细胞及计算机辅助计数；光学显微镜或荧光显微镜等。 因此将其列为两种测定方法。

本文的优缺点在于本文前期行meta 分析及已发表的meta 分析[45-46]均示异质性大，通过定量的分析具有明显的偏倚， 因此meta 分析结果的循证证据等级有待进一步验证，遂虽有具体的数据，因为异质性大的问题，行定性的分析即依据有效文献的研究质量，通过对每篇有效文献的结论进行总结，阳性表示纳入的有效文献支持复发性流产患者配偶精子DNA 碎片指数是高于配偶无复发性流产史的正常生育男性，阴性则持复发性流产患者配偶精子DNA 碎片指数与配偶无复发性流产史的正常生育男性无差异的观点，判断当前的有效文献结论是否多数一致，若结论为阴性则根据纳入研究文献的质量及结论进行分析，寻找到得出不同结论的原因，（在本文中有4 篇研究报告两组没有差异，解释同上），进一步验证分析每个研究结论的可靠性， 针对评分低的文献，对其结论也持谨慎的态度，综合所有的有效文献，得出偏倚相对较小的正确结论，所以说我们得出的结论是更加可靠的。 此外，两篇meta 分析[45-46]纳入前瞻性英文文献，定量分析两组精子DNA 碎片指数情况，通过分亚组，异质性依旧很大，虽然结论相对统一，但纳入文献有限，截止日期为2018 年10 月份。此系统评价，截止日期2019 年7 月10 日，更加全面、合理及说服力。

虽然复发性流产与女性有很大的相关性， 但男性伴侣可能在某些复发性流产病例中发挥重大作用。 因此，在未来的研究中，将精子DNA 碎片检查纳入复发性流产的常规检查中， 以期进行相应治疗来改善精子DNA，达到成功受孕的目的。