先天性双侧输精管缺如患者睾丸组织中CFTR 蛋白的表达及意义

白 松 吴 斌

中国医科大学附属盛京医院 泌尿外科（辽宁沈阳 110004）

前 言

先天性双侧输精管缺如 （Congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD,OM IM 277180） 是导致男性不育的重要原因[1]，约占男性不育的2%～6%，占梗阻性无精子症的25%， 是常见的常染色体隐性遗传疾病，发病率为1/1000。 临床一般表现为双侧输精管缺如、精液量减少、精囊及附睾尾发育不良或缺失[2]。 目前的治疗方法主要为经附睾或睾丸取精联合卵泡浆内单精子注射（ICSI）技术以达到生育目的。

CFTR 基 因 （Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator,OM IM 602421）编码一种ATP 依赖的跨膜蛋白，具有介导氯离子、碳酸氢根离子和水分子进行跨膜转运的功能，在呼吸道、消化道和生殖道的上皮细胞多有表达。CFTR 基因突变可以导致CBAVD 的发生，但是CFTR 基因突变对CBAVD 患者睾丸生精功能是否造成影响， 相关研究较少而且一直备受争议，CFTR 蛋白在睾丸组织中的表达情况也未见报道。

本研究通过对66 例CBAVD 患者的睾丸穿刺组织行CFTR 蛋白免疫组化检测和睾丸生精功能评价，旨在探索我国CBAVD 患者睾丸组织中CFTR 蛋白的表达与睾丸生精功能的关系。

材料和方法

一、标本收集

2008 年8 月至2014 年1 月在盛京医院就诊的66名CBAVD 患者为实验组； 实验组标本来自睾丸穿刺活检术，本实验经过盛京医院伦理委员会批准，所有入组患者均签署知情同意书。CBAVD 患者纳入标准[3]：1.触诊双侧精索未触及输精管，睾丸大小正常（Prader 睾丸模型＞12m L）， 两名专科医师同时查体；2. 无囊性纤维化其它症状，排除慢性胰腺炎和慢性阻塞性肺疾病等；3.精液分析检查至少3 次，无精子，射精后尿液沉淀后也未见精子以除外逆行射精， 精液量＜1.5m L，PH＜6.4，精浆果糖＜13umol/m l 和ɑ-糖苷酶＜20umol/m L；4. 超声示附睾头饱满，呈网格状，可伴有附睾尾和精囊的缺失或发育不良；5. 性激素水平正常；6. 染色体正常；7. 行TESE-ICSI 辅助生殖；8.无家族遗传疾病。

二、取材、石蜡包埋和免疫组化实验方法

取材：术区消毒铺无菌单，局麻成功后，使用18G穿刺活检针（Bard，美国）取睾丸组织2 条，大小约0.5×0.08cm，将其中1 条组织进行石蜡包埋；固定：4%多聚甲醛固定24h；冲洗：流水冲洗24h；脱水和透明：80%乙醇2h →90%乙醇2h →95%乙醇40min →无水乙醇40m in →二甲苯10m in →二甲苯10m in；浸蜡：软蜡1h→软蜡1h→硬蜡1h；包埋：生物组织包埋机包埋，制成蜡块；石蜡切片，厚度3um，然后放入烤箱65℃，4h；常规脱蜡，水化：二甲苯20min →二甲苯20min →无水乙醇10min →95%乙醇10min →90%乙醇10min →80%乙 醇10min；3%H2O2孵 育10m in，PBS 冲 洗，3 次×3min；高温高压抗原修复3min，自然冷却；滴加1:400稀释的CFTR 兔抗人多克隆抗体 （RLTO888， 睿瀛生物， 中国），4℃放入湿盒内过夜；PBS 冲洗，3m in×3 次，滴加HRP 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体 （PV-6000 18m l， 北京中杉金桥， 中国），37℃孵育30m in；PBS 冲洗，3m in×5 次，DAB 显色剂显色，结合显微镜检查（E800 Nikon，日本），3-5m in，显色合格后自来水冲洗终止染色；苏木素复染3min；流水充分冲洗反蓝10m in；脱水，二甲苯透明：80%乙醇10m in →90%乙醇10m in →95%乙醇10min →无水乙醇10min →二甲苯20m in →二甲苯20min；中性树胶封片。

阳性对照使用附睾组织， 空白对照用PBS 替代CFTR 兔抗人多克隆抗体。

三、免疫组化结果判定标准

使用Nikon E800 显微镜及NIS-Elements F4.3 软件采集图像。 CFTR 蛋白免疫组化结果判定标准：两名病理科医师同时单独阅片， 对于有争议的结果讨论后再决定，每个标本观察5 个20×10 高倍视野，计数阳性细胞占整个视野的百分比：≦5%、5-25%、26-50%、51-75%和76-100%分别记录为0、1、2、3 和4 分； 着色程度：无着色、淡黄、棕黄和棕褐色分别记录为0、1、2 和3 分，两者相乘结果为最后得分， 根据得分：0、1-4 分、5-8 分和9-12 分分别记录为阴性-、弱阳性+、阳性++和强阳性级+++。

四、睾丸生精功能障碍Johnsen 评分标准

10 分：精子发生功能完整，精子放出正常；9 分：精子发生功能减低，精子放出少见；8 分：精子发生功能减低，精子放出不可见；7 分：精子细胞分化障碍，多数未成熟的精子细胞；6 分：精子细胞分化障碍，少数未成熟的精子细胞；5 分：初级精母细胞成熟受阻，多数初级精母细胞；4 分：初级精母细胞成熟受阻，少数初级精母细胞；3 分：精原细胞阻滞；2 分：唯支持细胞综合征；1 分：生殖道萎缩。

五、数据统计分析

使用SPSS 22.0 软件，Kendall'tau-b 相关系数，P＜0.05 认为有意义。

结 果

一、免疫组化结果

CFTR 蛋白在睾丸支持细胞和生精细胞内均有表达，着色主要位于细胞浆及细胞膜，具体见图1。

图1 CFTR 蛋白免疫组化在睾丸组织中的表达

二、CBAVD 患者睾丸组织CFTR 蛋白表达情况

CBAVD 患者CFTR 蛋白在睾丸生精上皮及支持细胞的表达强阳性、 阳性、 弱阳性和阴性分别为：5(7.59%)、33(50.00%)、25(37.87%)和3(4.54%)。

三、CBAVD 患者睾丸生精功能评分

CBAVD 组患者睾丸生精Johnsen 评分7-10 分的比例分别为3 (4.45%)、27 (40.9%)、28 (42.42%) 和8(12.23%)。

四、CFTR 蛋白表达与睾丸生精功能评分的相关性

Kendall'tau-b 等级相关分析显示，睾丸内CFTR 蛋白表达水平与生精功能呈强正相关性，CBAVD 组Kendall'tau-b=0.785，P＜0.01。

讨 论

1989 年Riordan 等首先克隆了CFTR 基因的cDNA 片段并鉴定了其产物CFTR 蛋白[4]， 该基因位于7q31.2[5]，全长250kb，有27 个外显子，mRNA 序列长度6128bp，编码CFTR 蛋白，由1480 个氨基酸组成，相对分子质量约为168kDa[6]。

CFTR 蛋白属于cAMP 依赖的跨膜蛋白质[7]，位于上皮细胞顶膜， 主要为氯离子跨上皮运动提供选择性通道，此外对钠离子、碳酸氢盐和水分子的跨膜流动也具有重要的作用。 广泛分布于呼吸系统、消化系统、生殖系统和汗腺等组织中， 以维持人体的电解质平衡和内环境稳态。 根据CFTR 蛋白缺失的程度可以有不同的临床表型，包括囊性纤维化（OM IM 219700,cystic fibrosis,CF）、 高氯性的汗液分泌、 弥散性支气管扩张（OM IM 211400）、CBAVD 和急性或慢性反复复发性胰腺炎（OM IM 167800）等[8]。

精子的发生非常复杂， 由多潜能干细胞经减数分裂最后发育成精子，受到卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和雄激素(T)等多种激素的调节，这一过程发生在睾丸曲细精管及支持细胞内。CFTR 蛋白在人类生殖系统有表达，可能对睾丸的生精微环境有重要作用，但是CBAVD 患者睾丸生精功能是否受到影响， 研究较少而且一直备受争议，因为研究结果大相径庭，从正常到严重的无精症均有报道[9,10]。

Li 等[11]研究发现CBAVD 患者睾丸内精子细胞头部畸形，线粒体鞘缺失和顶体内陷，支持细胞内降解小体增多，细胞之间连接疏松。 Hui 等[12]在敲除CFTR 基因小鼠的睾丸中，发现生精细胞停止更新，最终会导致唯支持细胞综合征， 认为CFTR 基因可能是通过HCO3-/sAC/cAMP/CREB 通路和NF-kB/COX-2/PGE2通路来调节睾丸生精功能。Lu 等[13]研究也发现CBAVD患者行辅助生殖时伴有更高的失败风险。

目前在CBAVD 患者中，CFTR 基因突变在导致CBAVD 的同时，是否会影响睾丸的生精功能以及睾丸组织内CFTR 蛋白的表达情况未见相关研究。

本研究首次报道了我国CBAVD 患者睾丸内CFTR 蛋白的表达情况及睾丸生精功能情况。免疫组化结果显示CFTR 蛋白可同时表达于睾丸内的支持细胞及曲细精管的生精上皮细胞， 着色主要位于细胞浆和细胞膜。CFTR 蛋白在睾丸生精上皮及支持细胞的表达以阳性和弱阳性为主，约占87.87%（58/66），且有3 例为阴性。 这表明部分CBAVD 患者睾丸内生精上皮及支持细胞的CFTR 蛋白表达下降，而CFTR 蛋白是重要的离子和液体通道， 对睾丸生精功能非常重要， 所以CFTR 蛋白表达的减少也可能会对CBAVD 患者的睾丸生精功能造成伤害。

CBAVD 患者中睾丸生精Johnsen 评分8 分及以下的生精功能障碍患者比例达45.45%（30/66）， 甚至有3例患者仅为7 分，睾丸内未见精子，导致无法行辅助生殖。 同时本研究也发现CFTR 蛋白在睾丸组织中的表达与生精功能 Johnsen 评分有强正相关性，Kendall'tau-b 等级相关系数为0.785。 这表明CFTR 蛋白在睾丸组织中表达水平下降可能是影响睾丸生精功能的原因之一。

可见CFTR 基因在多个方面广泛的影响着男性生育，不仅会导致双侧输精管缺如，同时还会引起睾丸内CFTR 蛋白表达的减少，进而对睾丸的生精功能造成影响，这对睾丸取精行ICSI 辅助生殖技术来说是一个挑战。

结论

CBAVD 患者睾丸内的CFTR 蛋白表达以阳性和弱阳性为主， 可表达于睾丸内支持细胞及生精上皮细胞，以细胞膜和细胞浆为主；部分CBACD 患者存在生精功能障碍，CFTR 蛋白在睾丸组织中的表达水平与生精功能存在强正相关性。