卵子激活剂对无精子症患者冻融睾丸精子ICSI 后妊娠结局的影响*

彭礼繁 张小建 廖梅旭 李晓洁 余 鲲 龙华洋

四川省医学科学院·四川省人民医院辅助生殖医学中心（四川成都 610072）

卵胞质内单精子注射(Intracytoplasm ic sperm injection，ICSI)受精失败的原因是多方面的，其主要原因在于卵母细胞激活不足， 而导致卵母细胞激活失败的首要原因在于精子缺陷， 精子的异常程度直接决定ICSI成功率[1]。 睾丸精子抽取术（Testicularspiration，TESA）是有创手术， 且睾丸精子的有无和活力的好坏通常和穿刺部位有关。 因此， 在进行诊断性TESA 时如果发现有活动精子时会及时把精子冷冻起来， 复苏后用于ICSI，可以减少反复穿刺带给无精子症患者生理和心理上的创伤，但由于睾丸精子本身活动力低，冻融后会进一步降低睾丸精子的活动力， 胚胎发育和临床结局均不如新鲜睾丸精子。 目前有研究如何从不活动的精子中来筛选活精子来提高ICSI 的效率[2]。 也有报道人工辅助激活卵子技术（assist oocyte activation，AOA)联合ICSI 应用于无精子症患者， 并且获得临床妊娠及健康新生儿[3]。 本研究比较了AOA 对冻融睾丸精子ICSI 后的胚胎发育和临床结局的影响，旨在解决AOA 的临床应用提供进一步的依据。

资料与方法

一、一般资料

2015 年1 月至2019 年12 月就诊于我中心行ICSI的不孕周期患者，均获得患者的知情同意。 男方排除重大疾病和遗传性疾病，根据第五版WHO 标准诊断为非梗阻性无精子症， 对其采用经皮睾丸穿刺精子抽吸术(Testicular sperm aspiration,TESA）获得精子，经过冷冻复苏后用于ICSI。 将这些患者依据是否添加卵子激活剂CultActive 分为：冻融睾丸精子组(A 组)，使用卵子激活剂CultActive 的冻融睾丸精子组(B 组)，新鲜睾丸精子组(C 组)。

二、方法

（一）促排卵方案

采用常规长方案超促排卵， 前一月经周期的第19～21 日用曲普瑞林 (达菲林， 法国益普生公司)1.3～1.8mg 降 调 节， 月 经 第2～3 日 查 血 黄 体 生 成 素(luteinizing hormone releasing hormone, LH) 和雌二醇(Estradiol,E2) 值， 达充分降调节标准后用果纳芬(Gonal-F,瑞士Serono)或丽申宝(中国丽珠公司)促排卵，当超声检查显示至少3 个直径≥17 mm 的卵泡时， 当日患者接受5 000～10 000 U 的HCG(中国丽珠制药)以诱发卵泡成熟，32～36 h 后，经阴道超声引导下采卵。

（二）睾丸精子的获得

患者于局麻下行诊断性TESA 术，绷紧阴囊皮肤，在睾丸中部用睾丸穿刺抽吸针垂直阴囊皮肤穿刺，利用负压吸取少量睾丸组织后并放入培养液中， 在体式显微镜下用1m L 注射器针头将睾丸组织撕碎， 并观察有无活动精子。

（三）睾丸组织的冷冻

按体积比1∶1 加入精子冷冻保护剂（20%甘油）放于精子冷冻管内， 待睾丸组织与精子冷冻保护剂充分混匀后，在液氮上方悬吊20m in 后投入液氮中冷冻保存。

（四）睾丸组织的复苏

女方取卵当日，从液氮中取出冷冻管迅速投入37℃水浴10 m in 融解后， 经微量梯度离心后将沉淀置于37℃、6%二氧化碳培养箱中培养2～3 h 后待用， 若无活动精子则采用彭礼繁等[4]的方法选择活动精子行ICSI。

（五）卵子激活剂

CultActive 的使用ICSI 后，用巴士吸管立即将卵子移入含有30μM 卵子激活剂CultActive 中，15m in 后用培养液G-1 充分洗涤2～3 遍后放入新的培养液G-1 液滴中，放入37℃、6%二氧化碳培养箱中继续培养。

（六）受精和胚胎培养

ICSI 后18～19h 后观察卵胞浆内出现2PN 为正常受精，其余为异常受精。受精卵在卵裂培养液(G-1)中继续培养至72h 观察发育情况，并进行胚胎分级。 以胚胎细胞数≥6 个，卵裂球大小较为均匀，碎片≤20%为可用胚胎。 于取卵后72h 移植，移植胚胎数目1～2 枚，胚胎移植后给予黄体酮支持黄体。 移植后14 d 左右测血hCG，移植29～31 d 行B 超检查，发现孕囊即为临床妊娠。

三、胚胎的评估标准

按照本中心常规胚胎评分标准，48 h 发育为4 细胞,72h 细胞数为7～9 细胞， 碎片≤15%， 大小稍有差异，即最大的卵裂球与最小卵裂球体积比＜1.5，无多核出现，为第3 天优质胚胎；72 h 相比48 h 有发育且细胞数4～12 细胞、碎片程度≤30%，为可利用胚胎。

四、统计学方法

采用SPSS17.0 软件进行统计学分析。 数据以均数±标准差或率(%)表示，组间两两比较采用t检验或卡方检验。P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有极显著统计学意义。

结 果

一、患者基本情况比较

三组患者在年龄、不孕年限、促性腺激素用量、促性腺激素使用天数、获卵数上均无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

二、患者的胚胎发育情况及妊娠结局比较

三组患者在年龄、不孕年限、促性腺激素用量、促性腺激素使用天数、获卵数上均无统计学差异(P＞0.05)。B 组在2PN 率、 优胚率、 可利用胚胎率上均高于A、C组，但无统计学差异(P＞0.05)。 三组患者在分裂率上也无统计学差异(P＞0.05)。 B 组在受精率上明显高于C 组(P＜0.05)，且显著高于A 组(P＜0.01)。 B 组在临床妊娠率上显著高于A、C 组(P＜0.01)。 见表1。

表1 三组患者临床资料和胚胎发育情况比较

讨 论

ICSI 借助显微注射仪直接将精子注射到卵胞浆内，绕过了常规IVF 精子与透明带的结合、顶体反应、精子与卵细胞膜的融合等来实现受精的过程。 ICSI 不仅能使用射出精子， 还能采用附睾或睾丸中的精子来使卵子完成受精和并维持后续的胚胎发育， 取得和常规IVF 一样的妊娠结局。 和新鲜精液中的精子相比，睾丸精子成熟度和活动能力均有不同程度的下降； 其如果再经历冷冻和复苏过程， 其活动力和受精能力均会进一步的减弱。

受精是精子和卵子之间相互作用的多步骤、 多分子参与的复杂过程， 这其中包括了精子获能、 顶体反应、精子穿过卵子透明带、精子和卵子质膜融合、卵子皮质反应、卵子激活、雌雄原核形成等过程。 受精过程也是配子相互激活的过程，一是卵子对精子的激活（卵子对精子的趋化作用、初级结合诱导精子的顶体反应、穿透并释放精子激活因子）， 二是精子对卵子的激活（内质网钙离子的释放、形成钙震荡、皮质颗粒反应、启动第二次减数分裂），三是卵子的自身激活（PLC-ζ 水解PIP2、PIP2 分解成IP3， 激发钙震荡、CaMKII 的级联反应、CyclinB 降解姐妹单体分离）。ICSI 对卵子的刺激有以下几方面[5-6]：一是注射针的机械刺激，注射精子后适当地对卵母细胞胞质进行抽吸。 针刺进入卵母细胞后会诱发单个Ca2+波动，卵母细胞的酶可以修饰精子膜，释放一种“钙振素”使卵子活化，三磷酸肌醇(IP3)和其他第二信使系统被激活；二是注入精子的生物刺激，精子进入后也会发生一系列的生物反应， 进而刺激卵母细胞激活； 三是制动精子时通过注射针的机械应力划破精子尾部质膜，有利于释放精子中的卵子激活因子。

ICSI 对卵子的刺激有以下几方面[3]：一是注射针的机械刺激， 注射精子后适当地对卵母细胞胞质进行抽吸。 针刺进入卵母细胞后会诱发单个Ca2+波动，卵母细胞的酶可以修饰精子膜，释放一种“钙振素”使卵子活化，三磷酸肌醇(IP3)和其他第二信使系统被激活；二是注入精子的生物刺激， 精子进入后也会发生一系列的生物反应，进而刺激卵母细胞激活；三是制动精子时通过注射针的机械应力划破精子尾部质膜， 有利于释放精子中的卵子激活因子。

ICSI 受精失败的主要原因在于卵母细胞激活不足， 而导致卵母细胞激活失败的首要原因在于精子缺陷， 精子的异常程度直接决定ICSI 成功率。 有研究表明，位于精子头部的PLC-ζ 可能是这种卵子激活因子，是影响生殖与男性不育的关键因素[5]。ICSI 受精失败多是由于精子缺乏卵子激活因子所引起。 有研究发现，将IVF 和ICSI 均失败的男性精子注入小鼠卵母细胞, 不能诱导Ca2+释放或引发Ca2+振荡； 这些精子都同时表现出了PLC-ζ 异常的现象[6]。 卵子激活决定受精过程能否完成， 而胞内钙离子震荡则是卵子激活的一个关键环节。PLC-ζ 可以调控IP3 介导的胞内钙离子的储存和释放。 有研究表明，去除精子中PLC-ζ 的活性成分，或者通过siRNA 技术干扰PLC-ζ 的表达， 均可显著降低钙振荡水平，甚至可以导致钙振荡的提前终止[7]。PLC-ζ表达的丧失或减少已广泛用于解释男性精子激活卵母细胞反复失败而导致的男性不育现象， 其原因可能是PLC-ζ 表达水平的缺失或减少，造成了PLC-ζ 高度保守区域的突变[8]。 有研究认为，在采用卵子激活处理后，其ATP 含量均较未处理前有了一定的提高， 说明卵子激活可以提高其代谢的ATP 产生水平[9]。 发生卵母细胞激活失败可能是由于注射时用力过大， 导致卵母细胞胞质结构改变而使卵母细胞死亡； 还有可能是未对精子进行适当地选择， 注射的精子是形态不规则或者死亡的精子， 因为其缺乏某种因子或相关因子生物活性缺乏而使卵母细胞未被激活导致卵胞浆内单精子显微注射受精失败[13]。

卵母细胞辅助激活 （assist oocyte activation，AOA)技术能最大程度地模仿精子在受精过程中的活动，可以有效弥补精卵结合时的卵子激活缺陷， 诱导减数分裂正常进行、雌雄原核形成以及胚胎的进一步发育。 对于ICSI 受精失败患者通常可以借助AOA，即通过物理或化学的方法使卵胞浆内产生一个或多个钙脉冲信号， 诱导卵子完成减数分裂可以有效地克服因卵母细胞激活不足引起的受精失败或受精率低， 并能获得正常发育的胚胎。采用AOA 的方法模拟自然状态下精子释放卵子激活因子引发钙离子震荡可以挽救ICSI 受精失败，AOA 方法包括机械刺激 （ICSI 中反复抽吸卵胞浆）、物理方法（电刺激活化卵子）、化学方法（乙醇、Ca2+载体、氯化锶、重组PLC-ζ 等激活卵子）以及蛋白质合成抑制剂和蛋白磷酸化抑制剂应用等[11-13]。 为改善冻融精子行ICSI 受精率和胚胎发育， 本研究中采用卵子激活剂CultActive（其有效成分为钙离子载体A23187）进行卵子激活。 卵子激活后明显提高了卵子的受精率和临床妊娠率，其优胚率和可利用胚胎率也有所提高。

尽管卵子激活的适应症随着临床的成功运用越来越广泛，但作为一项实验性技术，AOA 技术依然存在许多的未知性，其方案和时机也有待于进一步的探讨。 虽然子代安全性研究也未发现和自然受孕出生婴儿有差异， 但是仍需要更进一步的深入观察和多中心大样本的研究。