PCOS患者GDF-9、BMP-15、BAX表达特点及其与卵巢储备功能的相关性

程瑶瑶 李建辉 王淳 陈娟

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）常伴有心血管系统疾病、糖尿病及生殖系统功能障碍，亦是导致育龄期妇女内分泌异常及无排卵性不孕的主要原因之一［1］。但目前关于PCOS 的发病机制和具体病因仍存在分歧，并有研究［2］提示正确评估卵巢储备功能对正确诊断和治疗女性妇科内分泌疾病和不孕症具有重要意义。

生长分化因子-9（Growth differentiation factor-9，GDF-9）、骨形态发生蛋白15（human bone morphogenetic protein 15，BMP-15）、BAX蛋白可参与颗粒细胞和卵母细胞的代谢调节过程，可调控卵母细胞成熟及卵泡发育，研究［3］证实当卵源性细胞代谢障碍是导致患者生育能力低下甚至不孕的主要原因。故而，本研究深入观察了PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平及其与卵巢储备功能的相关性，旨在为改善PCOS 患者妊娠率和卵泡发育提供理论支持，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年2月至2018年3月治疗的PCOS患者为研究对象。纳入标准［4］：①成年女性；②经超声检查确诊为多囊卵巢综合征；③无严重基础疾病者。排除标准：①合并其他生殖系统疾病；②不愿参与本项研究者。根据纳入排除标准共纳入病例数80 例，年龄28～47 岁，平均（36.15±2.38）岁；卵巢囊肿组纳入排除标准：成年女性，经超声等实验室检查确诊为卵巢囊肿者，无内分泌系统疾病者，根据纳入排除标准共纳入80 例，年龄27～48 岁，平均（36.19±3.12）岁。两组的一般资料比较无差别。本项研究经医院伦理委员会评审通过，所有患者及家属均已签知情同意书。

1.2 方法

2 组患者均于月经周期第3d 取空腹静脉血，同位素室化学标记免疫检测法检测基础性激素：卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）、雌二醇（Estradiol，E2）和睾酮（testosterone，T）水平；酶联免疫法（ELISA）检测2 组患者抗缪勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）和窦卵泡计数（antra1 follicle count，AFC）水平；留取2 组患者剥除的卵母细胞周期（cerebellum granule cell，CGC）细胞，常规培养并制成1×105的细胞悬液，均匀涂至聚赖氨酸处理的载玻片上，甲醇∶冷丙酮（1∶1）10 min 固定，标本-20℃保存备用。

免疫细胞化学染色检测两组患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平，标本常规PBS 冲洗并胰酶消化后兔血清（10%）30 min 封闭，分别计入羊抗人多克隆GDF-9、BMP-15 及BAX 抗体，4℃过夜；阴性对照过夜PBS 代替一抗，20 h 后取出标本30 min 复温，分别加入兔抗羊FITC 抗体，避光室温1 h 孵育；加入辣根过氧酶标记链酶卵白素工作液20 min 作用后PBS 冲洗，DAB 避光显色、封片［5］。

1.3 评价指标

观察两组研究对象GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平和卵巢功能的差异，分析PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平与卵巢储备功能的相关性。结果判定：阴性对照无黄色颗粒沉着，有棕黄色颗粒为阳性表达［6］。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.5 进行分析。计量资料以（）表示，组间比较行t检验，及Pearson 相关分析法进行分析。以P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平的比较

PCOS 组患者的GDF-9、BMP-15 和BAX 表达水平均高于卵巢囊肿组差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 2 组患者卵巢储备功能指标AMH 和AFC 水平的比较

PCOS 组患者的AMH 水平高于卵巢囊肿组，AFC 水平低于卵巢囊肿组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 两组患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平的比较［（±s）（ng/L）］Table 1 Comparison of expression levels of GDF-9，BMP-15 and BAX between the 2 groups［（±s）（ng/L）］

表1 两组患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平的比较［（±s）（ng/L）］Table 1 Comparison of expression levels of GDF-9，BMP-15 and BAX between the 2 groups［（±s）（ng/L）］

组别卵巢囊肿组PCOS 组t 值P 值GDF-9 42.12±3.16 55.03±2.07-30.567＜0.001 BMP-15 36.89±3.45 48.35±4.02-19.349＜0.001 BAX 35.12±2.67 40.35±3.11-11.412＜0.001

表2 2 组患者卵巢储备功能指标AMH 和AFC 水平的比较［n，（±s）］Table 2 Comparison of AMH and AFC levels in ovarian reserve function indicators between the 2 groups［n，（±s）］

表2 2 组患者卵巢储备功能指标AMH 和AFC 水平的比较［n，（±s）］Table 2 Comparison of AMH and AFC levels in ovarian reserve function indicators between the 2 groups［n，（±s）］

组别卵巢囊肿组PCOS 组t 值P 值n 80 80 AMH（ng/mL）5.98±1.11 8.13±1.76-9.242＜0.05 AFC（个）15.36±2.08 10.02±2.17 15.890＜0.05

2.3 2 组患者卵巢相关激素水平的比较

PCOS 组患者的FSH、LH、E2 和T 水平高于卵巢囊肿组差异统计学意义P＜0.05），见表3。

表3 2 组患者卵巢相关激素水平的比较（±s）Table 3 Comparison of ovarian related hormone levels between the 2 groups（±s）

表3 2 组患者卵巢相关激素水平的比较（±s）Table 3 Comparison of ovarian related hormone levels between the 2 groups（±s）

组别卵巢囊肿组PCOS 组t 值P 值FSH（pmol/L）4.08±1.04 5.49±1.12-8.251＜0.001 LH（pmol/L）5.21±1.08 8.56±1.25-18.138＜0.001 E2（pmol/L）50.27±6.04 69.15±7.23-17.925＜0.001 T（nmol/L）65.83±6.93 80.42±7.52-12.761＜0.001

2.4 PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平与卵巢储备功能的相关性

PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平与AMH、FSH、LH、E2 和T 水平正相关，与AFC 水平负相关（P＜0.05），见表4。

2.5 GDF-9、BMP-15、BAX 表达的比较

PCOS 患者的卵巢组织中GDF-9、BMP-15、BAX 阳性表达率明显高于卵巢囊肿患者,见图1。

表4 PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平与卵巢储备功能的相关性Table 4 Correlation between GDF-9，BMP-15，BAX expression levels and ovarian reserve function in patients with PCOS

3 讨论

痤疮、多毛、月经稀发、肥胖、不孕均为PCOS常见临床表征，属于常见妇科内分泌疾病。研究提示PCOS 患者出现代谢综合征、2 型糖尿病、高血压、血脂异常、及子宫内膜癌等疾病风险较健康人显著升高［7］。PCOS 常伴有生殖功能障碍和代谢异常，可能与遗传、环境、心理因素等关系密切，但确切发病机制尚不明晰［8］。

PCOS 临床症状及病因复杂并具有高度异质性，其中PCOS 患者多呈现出卵泡发育障碍的重要特征，因而卵泡相关因子的研究已成为PCOS 机制研究的重要方向［9］。GDF-9 属于转化生长因子-β超家族，是卵母细胞卵源的生长因子，主要以主、旁分泌等形式参与卵泡的发育、生长、成熟及排卵。研究［10］发现PCOS 患者卵巢组织GDF-9 多存在表达降低，提示GDF-9 水平的降低可能在PCOS的发病过程发挥了重要的作用。

BMP-15 亦属于TGF-β 超家族，具有调控卵巢局部细胞分化及增殖的功能并可调节卵母细胞的成熟。资料［11］显示BMP-15 可进FSH 分泌并刺激颗粒细胞分泌性激素，进而发挥抗凋亡作用。研究［12］中羊或鼠的BMP-15 被敲除后可出现不孕情况，这提示BMP-15 与卵巢具有重要联系。

BAX是BCL-2基因家族中细胞凋亡促进基因，其与BCL-2 水溶性蛋白具有同源性，BAX的过度表达对Bcl-2 产生阻抑作用并可拮抗BCL-2保护效应而导致细胞死亡。研究［13，14］发现Bax的表达广泛，血管平滑肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、呼吸系上皮细胞均可在其分布，此外Bax/Bcl-2 蛋白大小对反映细胞凋亡抑制作用强弱具有重要提示作用，故而认为BAX可作为促细胞凋亡基因之一。

卵泡发育过程精细且复杂，GDF-9可参与卵巢局部生长因子的调控，通过自分泌促进卵母细胞分裂并通过旁分泌调节卵泡膜细胞和颗粒细胞的增殖分化，进而影响卵巢蛋白酶、内固醇激素及相关因子的分泌。研究［15］发现BMP-15可调控生育力，敲除小鼠BNP-15 基因后，小鼠出现原始卵泡发育障碍，进而导致受精和排卵障碍，降低小鼠生育能力，故而机体BMP-15水平与卵巢功能具有密切联系；Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，因此认为，BAX是极重要的促细胞凋亡基因之一，可反映卵母细胞功能活性。

AMH 主要由窦状卵泡和窦前卵泡颗粒细胞分泌，与卵巢反应性及获卵数呈正相关，可作为预测促排卵过程卵巢活性及卵巢储备功能的重要血清标记物。本研究发现AFC 可对成熟卵泡总数进行预测，是评价机体卵巢储备功能的重要指标。相关性研究发现PCOS 患者GDF-9、BMP-15、BAX表达水平与AMH、FSH、LH、E2 和T 水平正相关，与AFC 水平负相关。上述结果提示多囊卵巢综合征患者的GDF-9、BMP-15、BAX 表达水平较高，且与AMH、AFC、FSH、LH、E2 和T 等卵巢储备功能指标水平密切相关。但本研究对上述因子的具体机制进行研究，还需要深入研究进行探讨。

综上所述，多囊卵巢综合征患者的GDF-9、BMP-15、BAX表达水平较高，且与AMH、AFC、FSH、LH、E2 和T 等卵巢储备功能指标水平密切相关。

图1 GDF-9、BMP-15、BAX 表达的比较Figure 1 Comparison of the expressions of GDF-9，BMP-15 and BAX