猪MBL2 基因序列特征分析

马 越，彭 帅，陈 朗，王馨敏，刘丽霞*

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

甘露聚糖结合凝集素（mannanbinding lectin, MLB）它的别名是甘露聚糖结合蛋白，胶凝素家族的成员中就有它的存在。MBL的本质是糖蛋白，由肝脏细胞合成MBL后进入到血液循环中的基因。MBL在机体天然免疫防御系统中有重要的意义，提高机体的抗病性必须要保证MBL在体内的浓度有着较高的水平才能达所需目的。甘露聚糖结合凝集素2（mannanbindinglectin2,MLB2）基因是MBL基因的一种，猪的MBL2基因位于14号染色体，有4个外显子和2个内含子[1]。研究表明MBL2在控制猪的疾病方面有很重要的作用，通过使用同源建模和折叠识别的方法可以构建MBL2蛋白的结构进而研究出两个蛋白质之间相互作用情况，进而有效地控制异种病毒的传播[2]。程少文等[3]研究通过构建MBL2蛋白与MASPS家族蛋白质的结构得到MBL2基因在补体系统激活及机体免疫防御等方面发挥重要的作用。夏铭崎等[4]研究表明免疫疫苗也可以控制PRRS的致病性，通过将基础种子接种到患有猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）健康且易感染的仔猪，在猪体内连续传五代以验证毒力返强风险是否存在于该疫苗株中。通过构建载体得到重组蛋白进而建立试剂盒用以检测PRRSV血清抗体，结果表明血清抗体与猪病毒性传染病特异性良好，可有效用于流行性病毒的研究[5]。刘玉芬等[6]研究表明哈白猪MBL与人类MBL在功能上的相似性，可以为用猪MBL代替人MBL来治愈患有甘露聚糖结合凝集素缺陷的人类疾病提供条件基础。袁焰平等[7]研究表明PRRS与MBL2基因有关连，PRRS属于动脉炎病毒属，可以使怀孕母猪流产、死胎甚至影响后代，为进一步研究猪蓝耳病提供了有力的依据。

近年来传染病对猪的危害范围越来越广泛，包括外界因素和自身等因素，然而猪繁殖与呼吸综合征是目前养猪业危害最大、控制最难的传染病之一。因此，近年来有关猪繁殖与呼吸综合征的防治、抗病育种和提高猪自身抗病力正在进行进一步的研究。该研究利用生物信息学分析的方法得出结论，可为MBL2基因作用机理的深入研究与控制猪的疾病提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 猪MBL2基因序列

从GenBank中查找已公布的猪MBL2基因编码区全长序列（登录号：NM_214125.1）。

1.2 生物信息学分析

对猪的MBL2基因CDS区编码蛋白的氨基酸序列进行预测并且分析、对该蛋白质的结构和功能以及理化性质也要进行预测并分析，实验用的网址和软件如表1所示。

2 结果与分析

2.1 预测并分析了猪的MBL2基因编码蛋白质的理化性质

表1 猪MBL2 基因生物信息学主要分析软件

表2 猪MBL2 基因编码蛋白质理化特性

利用E x P A S y 的在线程序Protparam预测猪MBL2基因的理化特性，其中包括蛋白质相对分子质量、等电点和氨基酸组成等（如表2）。猪MBL2基因共编码240个氨基酸，图1为20种氨基酸所占比例，甘氨酸（GLY）所占比例是最大的，占组成整个氨基酸的12.9%，组氨酸（HIS）、酪氨酸（TYR）和色氨酸（Trp）这3个氨基酸所占比例是最少的，每1个都只占1.2%。基因编码产物稳定指数为33.35。

2.1 预测并分析出猪的MBL2基因编码蛋白质的亲、疏水性

在计算机上找到E x p a s y 服务器，然后运用该服务器上面的Protscale程序对的猪MBL2基因编码蛋白质的疏水性警醒预测，结果（图2）表明此蛋白质第615和616位异亮氨酸（Ile）疏水性为＋1.867，由此可见其疏水性之强，然而位于102位的谷氨酸（Glu），它的亲水性为-0.356，我们可以得到它的亲水性是最强的。总体平均值为-0.317，所以呈亲水性。

2.2 预测并分析出猪的MBL2基因编码蛋白的N-糖基化位点

通过使用C B S 分析软件NetNGlyc 1.0对该基因编码蛋白的N-糖基化位点实行了预测（如图3）。结果发现，有4个潜在的N-糖基化位点在猪的MBL2基因编码蛋白质，它们分别是Asn96、Asn260、Asn369以及Asn31。

2.3 猪MBL2基因编码蛋白质信号肽分析

对猪的MBL2基因编码蛋白质是否存在信号肽进行了分析，结果如图4，MBL2基因编码蛋白质的分值曲线相对典型，其中C值与S值接近0.4，20-21位的氨基酸之间存在切割位点，剪切位点前Y值较高，剪切位点后Y值变低。由此可以判定猪MBL2基因编码蛋白质存在信号肽。

2.4 预测猪MBL2基因编码蛋白质二级结构和三级结构及分析

蛋白质的二级结构是指多肽链主链折叠产生的由主链内和主链间周期性氢键维系的有规则构象为蛋白质的二级结构，这些构象借助各种次级键共同构成其三级结构。蛋白质的结构决定其功能，而对蛋白质高级结构的预测和分析对了解蛋白结构与功能之间的相关性有着极其重要的意义。对猪MBL2基因编码蛋白质二级结构进行预测，结果如图5，由此可知在二级结构组分中Hh＜45%，Ee＜20%，α-螺旋（Hh）占23.33%，β-折叠（Ee）占13.75%，无规则卷曲(Cc)占62.92%。图6为其三级结构。

3 讨论

近年来有研究表明MBL2基因多态性与猪的肺炎、猪蓝耳病、肠道等疾病有关联。有关报道讲述在蛋白质翻译过程中的速率和蛋白质加工过程中的立体结构可能是因MBL2基因的影响，导致该基因蛋白质功能产生稳定性差异。在猪的多种组织器官中均能发现MBL2基因表达的影响结果，在肝脏中基因的表达量最高，MBL2基因可以合成MBL-C蛋白，多种真菌、细菌、病毒的表面糖基均可以与该基因结合，并通过MBL途径激活补体启动机体的天然免疫机制，从而达到杀灭或是清除病原体的作用，另外该蛋白还具有介导免疫调节和吞噬的作用[9-10]。MBL2作为MBL的家族成员之一，MBL与C1有相同的四级结构，可以激活补体、调理吞噬作用，产生强烈的免疫效应。目前国内外已有大量研究表明，大多数动物体内都具有M B L 2 基因，用来编码M B L-C蛋白，在猪、牛、恒河猴、短尾猴、大鼠、小鼠体内都分离到了MBL蛋白。

研究分析了MBL2基因的结构及功能，通过蛋白质的理化性质、跨膜结构、信号肽、糖基化位点和mRNA二级结构得到相应结果。预测结果可以看出，MBL2蛋白是由240个氨基酸组成的不稳定亲水性可溶性蛋白质。猪MBL2蛋白理论等电点为4.97，由此可判断猪MBL2蛋白是一种酸性蛋白质。猪MBL2蛋白半衰期为30 h，通常蛋白质半衰期越长其结构越稳定，猪MBL2蛋白不稳定指数为33.35，属于稳定蛋白。依据总平均亲水性（-0.317），可判断猪MBL2蛋白是可溶性蛋白。猪MBL2蛋白无跨膜蛋白结构，可能与MBL2蛋白氨基酸序列较短有关。猪MBL2蛋白具有4个潜在的N-糖基化位点，可能与其抗病性有关联。mRNA二级结构中无规则卷曲（Cc）占比62.92，因此判断猪MBL2基因编码蛋白质二级结构为无规则卷曲型[11-13]。

该研究系统地对猪MBL2蛋白的理化性质及基本结构进行了预测分析，揭示了模式识别受体MBL2理化特性，为深入探究猪MBL2基因的功能、作用机理、抗病育种以及猪蓝耳病提供了理论基础。