胃癌组织内皮素-1和P53表达及其临床意义

刘嘉庆 张大伟 李光

(1中国医科大学附属第一医院放疗科，辽宁 沈阳 110001；2长春市人民医院普通外科)

胃癌发病率居恶性肿瘤的第二位，死亡率居恶性肿瘤的第六位〔1〕。我国胃癌发病人口和死亡人口超过世界的40%〔2，3〕。胃癌的发生涉及多基因、多蛋白的改变过程，因此发现针对胃癌治疗的靶基因有重要的临床意义。内皮素(ET)是由21种氨基酸残基组成的具有血管活性的多肽，在诸多恶性肿瘤中呈现出高表达状态，其中以ET-1表达更为突显。P53基因是人体抑癌基因，其失活对肿瘤形成起重要作用，本研究探讨胃癌组织中ET-1、P53基因的表达与胃癌病理因素的关系及ET-1与P53基因的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 中国医科大学附属第一医院2019年1～10月住院治疗的50例胃癌患者为胃癌组，其中女25例，男25例。年龄45～75〔平均(60±5.8)〕岁。术后明确病理诊断为胃癌，胃癌分期以2010国际抗癌联盟公布的病理、肿瘤、淋巴结(PTNM)分期为标准。其中乳头状腺癌10例，管状腺癌15例，低分化腺癌15例，黏液腺癌5例，印戒细胞癌5例。同时将距离肿块边缘5 cm外的对应癌旁正常组织50例作为对照组。纳入标准：(1)术前均行胃镜检查，明确病理诊断为胃癌；(2)未接受过放、化疗或靶向治疗；(3)预期生存期>3个月；(4)心、肝、肾等主要脏器功能基本正常。排除标准：(1)接受过放、化疗或靶向治疗；(2)骨转移患者、存在严重的骨质疏松；(3)存在严重或不能控制的全身性疾病的证据；(4)无法控制的活动性感染；(5)各类传染病。患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，均知情同意，并经伦理委员会批准。

1.2实验试剂 ET-1-P53兔抗人多克隆抗体，免疫组化试剂盒购自长春可研生物有限公司。

1.3实验方法 标本均采用10%甲醛溶液固定。常规石蜡包埋、切片、染色。取石蜡组织常规连续切片，厚约4 μm。步骤分别如下：

胃癌组织ET-1检测：采用免疫组化法(IHC)测定，所检测标本用ABC法标记。具体步骤如下：①制作石蜡切片；②脱蜡；③去除内源酶 3%H2O215 min；④蒸馏水与0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)浸洗；⑤一抗：兔抗大鼠ET-1抗血清(上海德波生物技术有限公司)1∶400，4℃过夜孵育；⑥PBS 浸洗；⑦二抗：生物素化羊抗兔抗血清1∶500，37℃ 30 min；⑧PBS浸洗；⑨三抗：ABC复合物，1∶100，37℃40 min；⑩二氨基联苯胺(DAB)显色，5 min。每例切片选5个高倍视野(×400)，随即选测80～100个ET-1细胞的吸光度值，计算平均吸光度值，以平均值(A)表示细胞中的ET-1的含量。

利用常规的ABC法对P53蛋白进行检测，微波修复抗原。采用免疫组化En Vision二步法，实验步骤按照试剂盒说明书操作。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织作阳性对照。按照染色的强度计分，0分为无色，1分为浅色、2分为棕色、3分为褐色。阳性细胞百分比按照总分3分来测定，≤0.05是0分，0.06～0.25为1分，0.26～0.50为2分，≥0.51为3分。

1.4结果判定 ET-1表达主要位于细胞质，细胞膜呈少量的阳性表达，出现淡黄色或棕色颗粒者为阳性表达，若阳性细胞在标记的细胞总数中超过60%以上者，标记为阳性病例。P53蛋白表达位于细胞核，呈现淡黄色或棕色颗粒分布为阳性细胞。在光学显微镜下进行观察大于5个高倍视野，计数≥1 000个细胞中的阳性细胞，阳性细胞数<10%为阴性，≥10%为阳性。

1.5统计学方法 采用SPSS15.0统计软件进行χ2检验和Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1两组ET-1和P53蛋白的表达 胃癌组ET-1和P53蛋白表达阳性率〔38例(76.0%)，41例(82.0%)〕均显著高于对照组〔11例(22.0%)，10例(20.0%)；P<0.05〕。

2.2胃癌组织中ET-1和P53的表达与临床病理因素的关系 有无淋巴结转移、不同临床分期患者ET-1和P53蛋白阳性表达率差异有统计学意义(P<0.01)。组织学分级患者ET-1和P53蛋白阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 胃癌组织中ET-1和P53表达与临床病理因素的关系〔n(%)〕

2.3ET-1和P53蛋白表达的相关性 ET-1和P53蛋白共同阳性32例，共同阴性3例，二者呈正相关(r=0.511,P=0.000)。

3 讨 论

ET是1988年由Yanagisawa等〔4〕首次从培养的猪主动脉内皮细胞上清液中分离并纯化出来的，由21种氨基酸残基组成的血管活性多肽。ET由血管内皮细胞产生释放，以极低的生理浓度释放，其中以ET-1生理作用最强，在恶性肿瘤患者血清中ET-1浓度最高，其主要作用于周围淋巴结，在肿瘤侵袭中表现出器官特异性〔5〕。在乳腺癌患者的血清中ET-1水平明显增高，且与肿瘤恶性程度呈正比〔6〕，浸润性癌中ET-1过度表达并激活水平基因转移(HGT)，从而促使其发生骨转移〔7〕。ET不但能促使癌细胞淋巴管生成〔8〕，还能促进恶性肿瘤新生血管形成〔9〕，为肿瘤侵袭转移提供重要理论基础。

P53蛋白基因包括野生型和突变型，野生型P53蛋白基因位于染色体17p13.1〔10〕，属于细胞调控基因。当细胞受到损伤时，野生基因可有效诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡〔11〕，使得细胞在新的周期内得到修复和恢复，进而有效抑制肿瘤发生〔12〕。野生型P53蛋白半衰期较短，IHC在有效检测过程中不易检测到，在肿瘤组织的检测中，一般检测出的P53蛋白是经过突变后得到的P53蛋白〔13〕。

本研究结果表明ET-1和P53蛋白表达升高在胃癌发生过程中有一定的作用。有研究表明，ET-1能够使得P53蛋白基因发生突变，P53蛋白基因通过加强细胞转化加快恶化，在肿瘤治疗时起到有效抵制的作用。ET-1和P53蛋白异常表达共同参与了胃癌的发生及发展过程。本文结果与国内研究相一致〔14〕，说明ET-1是由癌组织本身分泌或释放的一种物质，其在血清中也呈高表达〔14〕。

综上，ET-1和P53蛋白表达与胃癌的发生、发展及转移之间存在一定的联系，能够在胃癌的早期检测和预后评估及靶向治疗中提供依据〔15〕。ET-1和P53蛋白在胃癌发生、发展的过程中相互调节的有效机制需进一步研究。