骨肉瘤患者的血浆长链非编码RNA UCA1表达及临床意义分析

井鸿雁，黄 斌，王 微

(吉林大学中日联谊医院,吉林 长春130033)

骨肉瘤是临床上最常见的骨组织原发恶性肿瘤之一，约占全部骨肿瘤的20%，也是儿童和青少年的常见恶性肿瘤。骨肉瘤具有进展快、转移早、预后差、易复发的临床特点，通常以疼痛、肿块、跛行等为主要表现，目前针对骨肉瘤的治疗以手术和化疗为主[1]，患者的预后与其临床分期具有密切的关系，非转移性骨肉瘤患者的术后5年存活率为50%-70%，而转移性骨肉瘤患者的术后5年存活率仅为15%-30%[2]，因此，提高对早期骨肉瘤的诊断效率是改善患者预后的重要手段。随着分子生物学研究的不断深入，针对骨肉瘤的基因层面研究已逐渐从蛋白质编码基因拓展至非蛋白质编码基因，长链非编码RNA(lncRNA)主要功能是对染色体发挥修饰作用，并在转录及转录后等多个层面发挥调控作用[3]，能够直接参与肿瘤的增殖、侵袭、转移等病理过程[4]。学者们已发现多种lncRNA通过复杂的机制参与了骨肉瘤的发生和发展，并介导其侵袭转移过程[5]。近年来，一些研究者开始尝试应用外周血lncRNA表达水平作为诊断骨组织恶性肿瘤的生物学标志物，取得了一定的进展[6]。尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)是一种在胚胎组织中普遍表达的lncRNA，而在成人仅有心脏和脾脏组织有少量表达，在多种肿瘤组织中均可观察到lncRNA UCA1的过表达，且其表达水平与肿瘤的侵袭转移行为有关，本文针对骨肉瘤患者的血浆lncRNA UCA1表达及临床意义进行了分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究资料

连续选取2017年6月-2019年6月在吉林大学中日联谊医院住院治疗、符合本研究入选标准的194例骨肿瘤患者作为病例组，其中，118例骨肉瘤患者为恶性组，76例良性骨肿瘤患者为良性组，选取同期100例接受体检者作为对照组，对三组研究对象的血浆lncRNA UCA1相对表达量进行检测和分析，所有研究对象均对本研究知情并签署知情同意书。

1.1.1纳入标准 病例组患者均符合美国国家综合癌症网络(NCCN)制订的《骨肿瘤临床指南(2017年版)》中的骨肉瘤和良性骨肿瘤诊断标准[7]，均经术前穿刺活检或术后病理检查确诊。所有患者均为初诊初治病例，临床资料完整。对照组研究对象均经临床检查排除骨肿瘤。

1.1.2排除标准 合并有其它部位原发恶性肿瘤、骨及重要器官畸形、心肺肝肾等重要器官功能不全、血液系统疾病、心脑血管卒中者；入院前已接受抗肿瘤治疗的患者；妊娠期或哺乳期患者。

1.2 观察指标

1.2.1一般资料调查 对所有研究对象的年龄和性别进行统计调查；对恶性组患者临床分期、肿瘤位置、远处转移情况进行统计调查；对良性组患者的肿瘤种类、肿瘤位置进行统计调查。

1.2.2血浆lncRNA UCA1相对表达量检测 病例组于入院次日采集空腹外周静脉血样本4 ml，对照组研究对象于体检当日采集空腹外周静脉血样本4 ml，经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝处理后，血样经3 000 r/min离心15 min后以微量取样器吸取血浆，移入1.5 ml EP管置于-20℃冰箱中保存待测。检测时将血浆样品置于冰上融化，吸取250 μl血浆样品，以Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取总RNA，以20 μl反应体系进行反转录获得cDNA。以U6为内参、采用实时荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)检测lncRNA UCA1相对表达量，引物序列及反应体系见表1、表2。反应程序为：起始模板变性95℃ 1 min，PCR模板变性95℃ 20 s，退火、延伸61℃ 31 s，连续反应45次。计算内参标准品与待测样品的循环阈值(Ct值)，以2-ΔΔCt计算lncRNA UCA1相对表达量，每个样品重复检测3次取平均值作为最终测量值。

表1 q-PCR反应引物序列

表2 q-PCR反应体系

1.3 统计方法

2 结果

2.1 三组研究对象的一般资料情况

三组研究对象在年龄、性别构成方面的差异无统计学意义(P>0.05)，恶性组与良性组患者在肿瘤位置、肿瘤大小方面的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 三组研究对象的一般资料情况对比

2.2 三组研究对象血浆lncRNA UCA1相对表达量的比较

三组研究对象血浆lncRNA UCA1相对表达量的差异有统计学意义(P<0.05)，其中，恶性组患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量高于良性组或对照组，良性组患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量高于对照组，各组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.3 不同临床特征骨肉瘤患者血浆lncRNA UCA1相对表达量的对比

在恶性组中，临床分期为Ⅲ-Ⅳ期的患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量高于临床分期为Ⅰ-Ⅱ期的患者，出现远处转移的患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量高于未出现远处转移的患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，而不同年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表4 三组研究对象血浆lncRNA UCA1相对表达量的比较

表5 不同临床特征骨肉瘤患者血浆lncRNA UCA1相对表达量的对比

2.4 血浆lncRNA UCA1相对表达量诊断骨肉瘤的价值分析

血浆lncRNA UCA1相对表达量在骨肉瘤诊断、骨肉瘤与良性骨肿瘤鉴别诊断、Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤诊断及骨肉瘤伴远处转移诊断中的AUC分别为0.854、0.876、0.711、0.719，均具有统计学意义(P<0.05)，在Cutoff值下，血浆lncRNA UCA1相对表达量在骨肉瘤诊断、骨肉瘤与良性骨肿瘤鉴别诊断中的灵敏度分别为0.727、0.661，特异度均达到了1.000，在Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤诊断、骨肉瘤伴远处转移诊断中的灵敏度分别为0.852、0.870，特异度分别为0.626、0.568。见表6、图1。

表6 血浆lncRNA UCA1相对表达量诊断骨肿瘤及骨肉瘤的ROC曲线分析

注：(A)诊断骨肉瘤的ROC曲线分析;(B)鉴别诊断骨肉瘤与良性骨肿瘤的ROC曲线;(C)诊断Ⅲ-Ⅳ期骨肉瘤的ROC曲线;(D)诊断骨肉瘤伴远处转移的ROC曲线

3 讨论

本研究结果显示，与健康人群相比，骨肿瘤患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量较高，特别是骨肉瘤患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量出现了显著上调，血浆lncRNA UCA1相对表达量能够作为骨肿瘤诊断和良性骨肿瘤与骨肉瘤鉴别诊断的辅助指标。近年来，仅有一项研究[8]针对骨肉瘤血循环中的lncRNA UCA1表达量进行了分析，该研究结果显示，骨肉瘤患者的外周血lncRNA UCA1表达上调，在诊断骨肉瘤中的AUC为0.831，这与本研究结果基本一致，且该研究结果还显示，高表达水平的lncRNA UCA1与较低的总生存率和无病生存率相关，是预测患者预后不良的独立指标，但是，该研究选取的检测材料为血清样本，而且对照组仅为健康人群，与本研究设计方案存在一定的差异。笔者认为，骨肉瘤患者血浆lncRNA UCA1表达上调可能与肿瘤细胞中lncRNA UCA1过表达有关，在肿瘤细胞凋亡过程中，其细胞浆物质通过局部血液循环进入体循环。相关研究[9]已证实，lncRNA UCA1在骨肉瘤组织和细胞系中存在明显的表达上调，且其高表达与肿瘤大小、肿瘤分级、远处转移、临床分期等临床特征密切相关，在敲除抑制lncRNA UCA1基因后，骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移受到抑制，细胞凋亡加快。通过细胞定位和组织表达谱分析，UCA1基因主要定位于癌细胞的细胞浆，其表达水平要明显高于癌旁组织，虽然肿瘤患者体液中的lncRNA UCA1表达水平一般远远低于肿瘤组织，但仍然可观察到患者体液样本中lncRNA UCA1表达水平的异常上升，比较典型的例子是，相关研究[10]已证实，膀胱癌患者尿液中的lncRNA UCA1表达水平可用于膀胱癌的诊断，不仅具有较高的敏感性和特异性，而且结果稳定性也较好；此外，针对肝细胞癌、食管鳞癌患者血清lncRNA UCA1表达的研究[11,12]也得出相似的结论。因此，针对具有骨肿瘤症状的患者，在应用影像学手段的同时，针对其外周血lncRNA UCA1表达量进行检测，能够为疾病的鉴别诊断提供一种无创性的参考指标，从而为考虑是否采用进一步的有创诊断手段提供依据。

本研究结果显示，临床分期为Ⅲ-Ⅳ期及出现远处转移的骨肉瘤患者的血浆lncRNA UCA1相对表达量上调更加显著，其水平可辅助诊断骨肉瘤临床分期、远处转移等，这提示了lncRNA UCA1的过表达可能与骨肉瘤侵袭、转移等生物学行为有关，血浆lncRNA UCA1相对表达量能够作为预测骨肉瘤疾病进展程度的辅助指标。近年来，研究者针对lncRNA UCA1的促癌机制进行了大量研究[13,14]，发现了lncRNA UCA1在促进肿瘤细胞生长增殖、侵袭转移、化疗耐药等多种恶性表型方面均发挥着关键性的作用，作为一种竞争性内源RNA，lncRNA UCA1主要通过作用于染色质修饰体、对染色体成环进行调节、转化为微小RNA(miRNA)、吸附miRNA等机制，在表观遗传学水平上对靶基因发挥间接调节作用，从而参与了肿瘤病理过程的调控。通过对非小细胞肺癌、黑色素瘤、咽鳞状细胞癌等的基础医学研究[15-17]，研究者已发现了lncRNA UCA1可对miRNA-185-5p、miRNA-582-5p、miRNA-143、p21等下游基因和β-Catenin等分子通路发挥调控作用从而发挥促癌作用，主要表现为抑制肿瘤细胞的凋亡并上调基质金属蛋白酶、Ki67等侵袭相关蛋白的表达。此外，进一步的研究[18]还证实，外源性加入lncRNA UCA1可促进癌细胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量的提升，增强癌细胞的生存及运动能力，从而促进肿瘤的侵袭和转移。而在针对骨肉瘤的研究[19-21]中，研究者也发现，骨肉瘤组织可通过表达C-C基序趋化因子配体18、低氧诱导因子-1α等诱导lncRNA UCA1的表达，而lncRNA UCA1能够通过调控miRNA-582及影响PI3K/AKT/mTOR、PTEN/AKT、Wnt/β-catenin等信号通路，促进上皮细胞-间充质转化(EMT)过程，从而促进骨肉瘤细胞的转移，最终促进了肿瘤的进展和远处转移。由于骨肉瘤具有早期转移快、化疗易耐药的特点，故中晚期或出现远处转移患者的预后通常较差，因此，临床医生应充分发挥lncRNA UCA1等遗传学指标的作用，努力提高对早期骨肉瘤的诊断效率，对远处转移等进行充分的预测，从而达到改善患者预后的目的。

值得提出的是，限于研究时间和经费，本文未对患者的术后生存期进行随访，也未将lncRNA UCA1与其它生物学标志物进行横向对比，这是本研究的不足之处，将在后续的研究中予以补充。

综上所述，骨肿瘤患者可出现血浆lncRNA UCA1相对表达量的上调，特别是骨肉瘤患者的血浆lncRNA UCA1过表达更加明显，血浆lncRNA UCA1相对表达量与骨肉瘤的疾病进展和远处转移有关，可作为骨肉瘤诊断及病情评价的辅助指标。