雷公藤甲素对雨蛙素诱导的慢性胰腺炎小鼠模型胰腺纤维化的影响

谭 鹏， 陈 浩， 王安康， 钱保林， 黄治伟， 石 昊， 高 琳， 付文广,

西南医科大学附属医院 a. 四川省院士(专家)工作站; b. 肝胆外科; c. 健康管理中心, 四川 泸州 646000

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是一种进展性炎症性疾病，在我国发病率约为13/105，且呈上升趋势，其中约2.9%的新诊断患者在1年内被确诊为胰腺癌[1]。CP的基本病理特征表现为不可逆的胰腺实质慢性炎症损害、间质纤维化及腺泡细胞萎缩消失，病程迁延且预后不良，严重影响患者生活质量[2]。雷公藤甲素作为环氧二萜内酯化合物，又称雷公藤内酯醇，是中药雷公藤中的主要活性成分之一[3]。近年来的研究[4-6]表明，其具有诸多药理活性，如抗癌、抗氧化、抗类风湿、抗老年性痴呆症等。然而，目前尚无报道雷公藤甲素具有抗CP的药理活性。本研究以雨蛙素诱导的CP小鼠模型为研究对象，基于NF-κB/IL-6信号通路，探索雷公藤甲素缓解CP发生的机制，阐明其新的药理活性。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级C57BL/6雄性小鼠15只，体质量(20±2)g，6～8周龄，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK(川)2015-030。实验动物饲养于西南医科大学SPF级实验动物房，许可证号：SYXK(川)2018-065。本研究方案经西南医科大学实验动物伦理委员会审批(批号：201906-4)，符合实验室动物管理与使用准则。

1.2 主要试剂 雨蛙素、雷公藤甲素购自MCE (美国)，小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒购自R&D Systems(美国)，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒购自Beyoeime(中国)，天狼猩红、马松染色试剂盒购自Solarbio(中国)，NF-κB/p65兔多克隆抗体、GAPDH鼠单克隆抗体购自Proteintech(中国)，IL-6兔多克隆抗体购自Servivebio(中国)，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)兔多克隆抗体购自abcam(英国)，二抗购自Proteintech(中国)。

1.3 CP小鼠模型的构建及分组 15只6～8周龄C57BL/6小鼠适应性饲养2周后，随机分为3组：对照组、雨蛙素组和雷公藤甲素组，每组各5只。雨蛙素组和雷公藤甲素组10只小鼠均给予腹腔雨蛙素注射50 μg/kg，每周注射3 d，6 次/d，每次间隔1 h，连续注射6周，构建CP模型，其中雷公藤甲素组5只小鼠在第3周开始同时腹腔注射100 μg/kg的雷公藤甲素，每周注射6 d，1 次/d，连续注射4周。对照组接受同雨蛙素组等剂量、同频率的0.9%生理盐水。所有小鼠均为第6周处理结束后处死。

1.4 样本采集及检测方法

通过外科手术摘除小鼠完整胰腺组织，称重后取胰腺中部组织将其平均分成2份，1份置于4%多聚甲醛中用于组织学检测；1份迅速置于液氮中，再转入-80 ℃冰箱，待提取蛋白行蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)检测。

1.4.1 胰腺组织病理学染色 胰腺组织HE染色观察病理改变，并采用Kusske评分标准[7]对其进行定量评估；天狼猩红染色及马松染色观察胰腺组织纤维化程度，通过Image J 1.43软件计算胰腺组织天狼星红染色红色信号及马松染色蓝色信号的平均光密度值。

首先将胰腺组织在4%多聚甲醛中固定24 h，然后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，最后通过切片机制作4 μm石蜡切片。使用HE染色、天狼猩红染色、马松染色试剂盒并按照说明书步骤进行检测。

1.4.2 ELISA检测血清中IL-6表达 在造模最后1 d通过摘除眼球法收集3组小鼠血液，室温静止放置30 min，3000 r/min离心15 min，吸取上清，使用小鼠IL-6 ELISA检测试剂盒并按照说明书步骤进行检测。

1.4.3 免疫组化检测α-SMA和NF-κB/p65 α-SMA为公认的纤维化程度的指标，NF-κB/p65为转录调控IL-6表达的关键转录因子，通过免疫组化染色观察其在胰腺组织中的表达情况，并通过ImageJ 1.43软件计算阳性信号的平均光密度值。

对4 μm胰腺组织石蜡切片进行常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，通过枸橼酸钠缓冲液高压抗原修复法进行抗原修复，3%H2O2室温孵育5～10 min以消除内源性过氧化物酶的活性，用10%山羊血清对切片进行封闭。使用NF-κB/p65抗体(1∶100)、α-SMA抗体(1∶100)于4 ℃孵育过夜，切片用PBS冲洗3次，二抗孵育1 h，使用DAB显色液进行显色，待显色完全后用蒸馏水洗终止反应。依次通过苏木精复染、盐酸乙醇分化、氨水返蓝、脱水透明，最后用中性树胶封片。

1.4.4 WB检测NF-κB/p65、IL-6及α-SMA 通过WB检测每组3只小鼠胰腺组织中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表达，并通过ImageJ 1.43软件进行灰度值分析。使用RIPA强裂解液(Beyotime)并按照说明书步骤进行胰腺组织的蛋白提取，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)对样品进行浓度测定。制备聚丙烯酰胺凝胶，依次进行电泳、转膜、封闭。加入一抗于4 ℃孵育过夜，然后加入相应的二抗室温孵育2 h，通过使用凝胶成像分析仪进行化学发光显影。

2 结果

2.1 胰腺组织重量比较 3组间胰腺组织重量比较差异有统计学意义(P<0.001)，雨蛙素组显著低于对照组和雷公藤甲素组(P值均<0.05)(表1)。

2.2 胰腺组织病理学染色结果 HE染色结果显示，3组间胰腺组织病理评分比较差异有统计学意义(P<0.001)。 与对照组比较，雨蛙素组胰腺腺泡细胞结构破坏和炎症细胞浸润程度更为严重(P<0.05)；与雨蛙素组比较，雷公藤甲素组腺泡细胞结构破坏和炎症细胞浸润显著缓解(P<0.05)(表1，图1)。

表1 3组小鼠各项结果比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与雨蛙素组比较，2)P<0.05。

注：a，对照组； b，雨蛙素组； c，雷公藤甲素组。

图1各组小鼠胰腺组织的病理学改变(HE染色，×200)

天狼猩红染色及马松染色结果显示，3组间天狼星红染色红色信号、马松染色蓝色信号的平均光密度值比较差异均有统计学意义(P值均<0.001)。与对照组比较，雨蛙素组胰腺组织胶原纤维表达显著升高(P值均<0.05)；与雨蛙素组比较，雷公藤甲素组胰腺组织胶原纤维表达明显降低(P值均<0.05)(表1，图2、3)。

注：a，对照组； b，雨蛙素组； c，雷公藤甲素组。

图23组小鼠胰腺组织的天狼猩红染色(×200)

注：a，对照组； b，雨蛙素组； c，雷公藤甲素组。

图33组小鼠胰腺组织的马松染色(×200)

2.3 血清IL-6水平的比较 ELISA检测结果显示，3组间IL-6水平比较差异有统计学意义(P<0.001)。雨蛙素组血清IL-6水平明显高于对照组(P<0.05)；与雨蛙素组相比，雷公藤甲素组血清IL-6水平明显降低(P<0.05)(表1)。

2.4 胰腺组织α-SMA和NF-κB/p65免疫组化结果 3组间α-SMA阳性信号平均光密度值比较差异有统计学意义(P<0.001)。雨蛙素组胰腺组织α-SMA蛋白的表达明显高于对照组(P<0.05)；与雨蛙素组比较，雷公藤甲素组α-SMA蛋白表达显著降低(P<0.05)(表1，图4)。

注：a，对照组； b，雨蛙素组； c，雷公藤甲素组。

图4各组小鼠胰腺组织α-SMA的免疫组化染色(×200)

3组间NF-κB/p65阳性信号的平均光密度值比较差异有统计学意义(P<0.001)。雨蛙素组胰腺组织中NF-κB/p65的表达明显高于对照组，且明显在细胞核内高表达(P<0.05)；与雨蛙素组相比，雷公藤甲素组NF-κB/p65蛋白的表达明显降低(P<0.05)(表1，图5)。

注：a，对照组；b，雨蛙素组；c，雷公藤甲素组。

图53组小鼠胰腺组织NF-κB/p65的免疫组化染色(×200)

2.5 胰腺组织WB检测结果 通过WB检测每组3只小鼠胰腺组织中NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表达，结果显示，3组间NF-κB/p65、IL-6、α-SMA的相对灰度值比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。与对照组比较，雨蛙素组NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表达水平明显升高(P值均<0.05)；与雨蛙素组比较，雷公藤甲素组NF-κB/p65、IL-6及α-SMA表达水平明显降低(P值均<0.05)(表2，图6)。

图63组小鼠胰腺组织NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的表达

3 讨论

CP是各种因素(酗酒、吸烟、损伤和遗传因素等)导致的一种不可逆转的慢性炎症性疾病，主要表现为大量成纤维细胞增生和细胞外基质在胰腺内沉积导致腺泡细胞损失和胰腺进行性纤维化[8-9]。目前临床上对于CP的治疗主要以缓解症状及控制并发症为主，缺乏对CP特效的治疗药物，故治疗效果不满意[10]。因此了解CP发生发展的分子机制，探索新的CP靶向治疗药物显得尤为重要。雨蛙素作为胆囊收缩素的类似物，通过反复腹腔注射可诱导小鼠出现较典型的CP病理表现[11]，因此本研究以雨蛙素诱导的CP模型为基础进行相关研究。

雷公藤甲素是雷公藤的主要生物活性成分，由于其独特的二萜三环氧化合物结构和多种生物活性，引起了广泛的研究和开发[12]。目前已有研究报道雷公藤甲素可以通过抑制NF-κB活性及CXCL11表达减轻重症急性胰腺炎(severe cute pancreatitis，SAP)时胰腺组织病理损伤[13-14]。本研究发现，雷公藤甲素组小鼠的腺泡细胞结构破坏和炎症细胞浸润程度较雨蛙素组明显缓解，且胰腺纤维化程度也显著弱于雨蛙素组，提示，雷公藤甲素除可以治疗SAP外，还可进一步用于CP的治疗。

NF-κB是一种具有多向性调节作用的核转录因子，其发挥主要生理作用的是p50和p65亚基组成的异源二聚体，当机体受到创伤后被激活，并参与调节多种炎性基因转录过程，介导急慢性炎症反应[15-17]。已有研究[18]表明，在雨蛙素诱导的小鼠CP模型中NF-κB/p65表达明显上调，且受NF-κB/p65转录调控的IL-6的表达也明显上调。在肺部炎症、多发性骨髓瘤、SAP的研究[19]中发现，雷公藤甲素通过抑制NF-κB通路的激活从而下调炎症因子的表达。本研究发现，与雨蛙素组相比，雷公藤甲素组胰腺组织NF-κB/p65的表达被明显抑制，且下游IL-6在胰腺及血清中的表达量都明显降低。以上结果表明雷公藤甲素可能通过抑制NF-κB/p65表达，进而下调炎症因子IL-6的表达与分泌，减缓雨蛙素诱导的小鼠CP。

本研究从组织和蛋白水平进行研究发现，雷公藤甲素可以减缓雨蛙素诱导的小鼠CP纤维化进程，同时明显抑制胰腺组织NF-κB/p65表达，为胰腺纤维化及CP的靶向治疗提供重要的理论基础，为CP的临床治疗及预防提供新的思路。

表2 3组小鼠胰腺组织NF-κB/p65、IL-6及α-SMA的灰度值比较

注：与对照组比较，1)P<0.05；与雨蛙素组比较，2)P<0.05。