牦牛MEF2A基因克隆与差异性表达分析

(1.西南民族大学 青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部重点实验室， 四川 成都 610041；2.西藏自治区农牧科学院省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏 拉萨 850009)

肌细胞增强因子-2(Myocyte enhancer factor 2, MEF2)定位于细胞核内，属于MADS-box转录因子家族[1]。MEF2蛋白最早发现于发育中的骨骼肌肌管，具有DNA结合活性，能够与肌肉肌酸激酶(MCK)基因启动子中的A/T序列相结合[2]。MEF2家族在脊椎动物中由4种亚基组成，分别包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D，在动物不同组织生长发育过程中发挥调控作用[3]。MEF2蛋白家族N端均含有高度保守的MADS-box结构域和MEF2结构域，其结构差异性主要集中在C端的转录活性区[4]。MEF2广泛存在于肌肉细胞中，且能够结合大多数肌肉特异性基因的启动子或增强子，增强相关基因的表达，可作为肌源性基因表达的主要调节物[5-6]。MEF2A是一种由MEF2A基因编码的蛋白质，位于染色体15q26，该蛋白在冠状动脉内皮细胞中高表达，在心脏和平滑肌细胞的形态发生和肌细胞生成过程发挥关键作用[7]。研究显示，MEF2A在骨骼肌和心脏组织中发挥作用存在差异，其靶向基因能够影响MAP激酶的活性和凋亡[8]；通过对MEF2A缺失的MBs(心肌细胞)RNA-seq分析，MEF2A具有两种不同作用，MEF2A的丢失不仅会导致肌肉功能的下调，还会造成与细胞迁移和运动相关基因的上调。

类乌齐牦牛主要生活在西藏自治区东部昌都市类乌齐县境内的高山草甸草原地区，海拔4 500 m以上，其形成历史悠久，具有基本一致的外貌特征和繁殖性能，属于以产肉为主的肉乳兼用型牦牛，是培育牦牛新品种或品系的重要基因资源[9]。本研究以普通牛MEF2A基因mRNA序列设计引物，克隆类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区，进行生物信息学和差异性表达分析，为进一步探讨MEF2A基因对牦牛肉质性状的影响提供基础数据，并为类乌齐牦牛特色性状的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取西藏自治区昌都市类乌齐县4.5岁健康成年的类乌齐牦牛作为试验样本，分别采集其臀肌、心脏、肝脏、肺脏等组织，用DEPC水处理后，迅速用锡箔纸包装，并置于液氮中保存备用。

1.2 主要试剂

Trizol RNA提取试剂盒(TIANGEN)；琼脂糖(Amresco)、D2000 DNA Ladder(BioMIGA)；反转录试剂盒(TIANGEN)；DNA纯化试剂盒(TIANGEN)；RNase-Free ddH2O；pMD19-T载体(TaKaRa)；DH5α感受态细胞等。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA提取及RT-PCR反应 称取80～110 mg组织样品于研钵中，边研磨边倒液氮，随后将研磨好的组织迅速转移至含Trizol裂解液的离心管，提取总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。采用分光光度计测定RNA样品的浓度及OD260/280值。利用DNase I去除残留DNA，然后反转录成cDNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，于-20 ℃保存备用。

1.3.2 引物设计 参照GenBank中普通牛MEF2A基因cDNA序列(NM_001083638.2)，采用Primer 5.0软件设计特异性引物(表1)，经NCBI Primer-Blast程序检测后，将扩增引物交由英潍捷基(上海)生物技术有限公司合成。

表1 牦牛MEF2A基因的引物Table 1 Primer of MEF2A gene in yak

1.3.3 PCR扩增 PCR总反应体系为25 μL：上下游引物各1 μL、Taq Green PCR Master Mix(2×, 1.25 mL) 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、DNA模板1 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，56.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环35次；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA纯化试剂盒纯化回收PCR产物，4 ℃保存备用。

1.3.4 目的片段TA克隆与鉴定 回收纯化后的PCR产物在16 ℃与pMD19-T载体过夜连接，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.3.5 生物信息学分析 使用NCBI中ORF Finder程序对类乌齐牦牛MEF2A基因进行开放阅读框分析，利用DNAStar软件分析碱基组成。运用SOPMA、PHYREZ、Raswin等在线软件预测MEF2A基因二级、三级结构。利用TMHMM Server v.2.0、NetPhos 3.1 Server等软件分析MEF2A基因的跨膜区、磷酸位点，PSORT Prediction在线软件对亚细胞定位进行预测和分析；利用MegAlign和MEGA 6.0软件进行同源性比对和系统进化树构建。

1.3.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 根据GenBank中β-actincDNA序列设计特异性引物，并以克隆所得MEF2A基因序列设计后续定量引物。qRT-PCR反应体系(10 μL)：上、下游引物各0.4 μL，模板cDNA 0.8 μL(将反转录后的cDNA稀释3～5倍使用)，2×SuperReal Pre-Mix Plus(SYBR Green) 5 μL，RNAase-Free ddH2O 3.4 μL。PCR扩增程序：Segment1：95 ℃ 30 s；Segment2：95 ℃ 5 s；60 ℃ 20 s，39个循环。溶解曲线由BIORED荧光定量PCR仪自带程序绘制。采用2-ΔΔCt法对MEF2A基因mRNA表达水平进行相对定量分析。

2 结果与分析

2.1 牦牛MEF2A基因总RNA提取

类乌齐牦牛肝脏组织总RNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，存在5S、18S、28S条带(图1)，说明RNA的完整性良好，满足后续试验需要。

2.2 牦牛MEF2A基因目的片段扩增与TA克隆

经检测MEF2A基因PCR扩增产物长1 882 bp，目的条带单一、明亮，片段大小与预期结果一致(图2)。筛选阳性菌液进行测序，经Blast比对分析，类乌齐牦牛MEF2A基因序列与普通牛MEF2A基因序列同源性达99%。

2.3 牦牛MEF2A基因CDS区核苷酸序列及编码氨基酸序列分析

应用NCBI中ORF Finder程序分析牦牛MEF2A基因序列，包括5个开放阅读框，根据Kozak法则，获得长1 469 bp ORF，起始密码子ATG位于269 bp处，终止密码子TAA位于1 738 bp处，由此得出牦牛MEF2A基因CDS区全长1 469 bp，其碱基组成分别为A (27.41%)、T(21.29%)、G(23.40%)、C(27.89%)，其中(G+C)略高于(A+T)，共编码489个氨基酸(图3)。

2.4 牦牛MEF2A蛋白理化性质分析

利用ProtParam与Proteam软件预测牦牛MEF2A蛋白的理化性质，可知牦牛MEF2A蛋白分子式为C2263H3601N647O742S20，分子量为52 385.58，总原子数为7 273，理论等电点(pI)为6.27，该蛋白属酸性蛋白质。氨基酸中Ser(13.9%)、Pro(11.7%)的含量较高，极性氨基酸占41%，疏水性氨基酸占39.9%，酸性氨基酸占9.0%，碱性氨基酸占10.0%(表2)。消光系数(γ=280 nm/( mol·cm) )为27 515，不稳定指数60.68，表明该蛋白质为不稳定蛋白。脂溶系数64.60，亲水性平均值为-0.604，故此蛋白为亲水性蛋白。

表2 牦牛MEF2A基因编码蛋白氨基酸组成Table 2 The composition of amino acid coded byyak MEF2A gene

运用ExPASy-ProtScale在线分析软件预测牦牛MEF2A基因编码蛋白的亲水性/疏水性(图4)，第30位Cys疏水性最强(Max=2.162)，第66位Glu亲水性最强(Min=-2.608)，MEF2A含有较强的亲水区域，属于可溶性蛋白。

使用TMHMM Server v.2.0软件对MEF2A蛋白进行跨膜区分析，结果显示MEF2A蛋白包含489个氨基酸，其氨基酸均位于细胞膜表面，未发现跨膜螺旋区(图5)，这与该蛋白质亲水性区域的分析结果基本一致。

2.5 牦牛MEF2A蛋白二级和三级结构预测分析

蛋白质二级结构主要是指多肽链主链骨架中局部的构象，对其进行预测分析可以有效认识蛋白质的空间结构[10]。使用SOPMA 在线软件预测牦牛MEF2A蛋白的二级结构，结果表明，牦牛MEF2A蛋白分别由63.83%无规则卷曲、21.06%α-螺旋、10.84%延长链和3.27%β-转角构成。用SWISS-MODEL在线软件对牦牛MEF2A进行同源建模，得到三级结构模型(图6)，发现其主要由无规卷曲、 螺旋和延长链在空间上折叠形成，与二级结构预测结果基本一致。

2.6 牦牛MEF2A亚细胞定位及蛋白质功能结构预测

利用PSORT II Prediction软件对牦牛MEF2A基因的亚细胞定位进行预测分析。结果显示，MEF2A基因在细胞核、细胞质、线粒体、分泌系统囊泡中的分布比例分别为52.2%、26.1%、17.4%和4.3%，在细胞核中的分布最多。利用Psipred的FFpred预测蛋白质功能，结果见图7，发现该蛋白主要富集在分子功能(Molecular Function,MF)、生物学过程(Biological Process,BP)和细胞组成(Cell Component,CC)3个部分；在生物学过程方面主要参与转录、调节基因表达、高分子生物合成过成、氮化合物代谢过程、以及RNA合成过程；分子功能方面则主要在调节区DNA结合、RNA聚合酶II调节区的DNA结合以及细胞骨架蛋白、微管蛋白、肌动蛋白结合方面发挥调控作用。

运用NetPhos 3.1 Server在线分析软件对牦牛MEF2A基因编码蛋白的磷酸化位点进行预测，结果显示该基因编码蛋白共含有71处磷酸化位点(图8)。其中包含丝氨酸(serine)磷酸化位点48处，苏氨酸(Threonine)磷酸化位点17处，酪氨酸(Tyrosine)磷酸化6处。

2.7 牦牛MEF2A同源性及系统发育分析

利用MegAlign软件对普通牛、家猫、家犬、绵羊、小鼠、金钱豹、宽吻海豚、抹香鲸、美洲野牛、白犀、马、东北虎、猴13个物种的MEF2A基因CDS区编码氨基酸序列进行Clustal W比对，结果见表3。通过Mega 6.0软件中NJ法构建系统进化树，其中美洲野牛和小鼠聚为一类，牦牛与普通牛、绵羊聚为一类，且氨基酸序列同源性较高，亲缘关系较为接近，与金钱豹、东北虎的亲缘关系稍远，符合进化规律(图9)。

2.8 牦牛MEF2A基因在不同组织间的表达

对牦牛MEF2A基因的臀肌、心脏、肝脏、肺脏进行实时荧光定量分析。结果表明，MEF2A基因在臀肌组织中的表达量最高，为2.500±0.405，其次是心脏(1.461±0.010)和肝脏(0.801±0.357)，肺脏最低(0.452±0.158)，不同组织表达量差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

MEF2A基因又称为MEF2因子，属于MADS超家族成员之一，存在于所有真核生物中。MEF2A基因在神经元、心肌细胞、免疫细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等多种特殊细胞类型中具有重要调控作用[10]。Zhu等[11]利用神经干细胞研究了转录因子MEF2A在体外神经元分化和发育中的作用，发现MEF2A存在于未分化的神经干细胞中，且分化后在神经元子集中的表达水平明显高于非神经元细胞，证明MEF2A与神经干细胞的分化和成熟有关。Meyer等[12]通过转录因子MEF2A改变下丘脑神经元形态，OTR-MAPK-MEF-2A通路在下丘脑神经元的形态学改变中起关键作用。Foroughmand等[13]研究显示MEF2A基因多态性与冠心病(CAD)病因显著相关。刘本荣等[14]认为，转录因子结合位点(TFBS)受到MEF2A启动子区SNPs的影响，其转录活性具有差异性，启动子的纯合度与CAD易感性呈正相关。此外，在畜禽育种方面，MEF2A基因被认为是影响屠宰性状与生长发育的候选基因。易恒洁等[15]揭示了MEF2A基因多态性与三穗鸭屠体性状的相关性。祁艳霞等[16]研究发现，在南阳黄牛肌肉发育过程中，MEF2A基因在3月龄时表达量最低，在12月龄和18月龄时表达量显著升高，随后表达量下降。彭邦星等[17]对兴义鸭的研究则阐明了MEF2A基因功能和结构对其遗传效应的影响。

表3 牦牛与其它物种MEF2A基因的序列同源性比对Table 3 Sequence homologies alignment of yak and other species for MEF2A gene

图9MEF2A基因的系统进化树
Fig.9 The phylogenetic tree ofMEF2AGene

目前，已有鼠、黄牛、猪、羊、鸭等物种MEF2A基因的研究报道，而关于牦牛MEF2A基因的研究却鲜有报道。本研究采用RT-PCR技术结合生物信息学分析方法，成功获得牦牛MEF2A基因CDS区核苷酸序列，全长1 469 bp，共编码489个氨基酸，这与陈付英等[18]对黄牛MEF2A基因CDS区克隆结果相似，且发现MEF2A基因长度和编码氨基酸残基数与普通牛、绵羊相似，与个别物种如家犬、马、家猫等略有不同。MEF2A基因第4位碱基G为偏好碱基，其翻译起始位点遵循Kozak规则，这表明MEF2A基因具有较高翻译效率。对类乌齐牦牛MEF2A基因编码蛋白的理化性质分析发现，丝氨酸和脯氨酸占比最大。作为一种非必需氨基酸，丝氨酸在对细胞膜的加工、肌肉组织和包围神经细胞鞘的合成中均发挥作用[19]，这与MEF2A基因参与细胞大分子生物合成的功能预测结果相一致。MEF2A蛋白的二级结构和三级结构在空间结构上主要由无规则卷曲、 螺旋和延长链盘旋折叠而成，其中无规则卷曲占63.83%。作为构成蛋白质高级结构的重要元素之一，无规则卷曲受侧链相互作用的影响较大，常参与构成酶活性部位和其它蛋白质特异功能部位，如在很多钙结合蛋白中能够与钙离子EF手型结构的中央环结合[20]。蛋白质功能预测表明MEF2A基因在细胞内部能够调节肌动蛋白结合过程，这间接势必会造成细胞骨架的分布状态发生变化，推测这可能与该蛋白结构中高比例的无规则卷曲相关。蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力与功能的重要调控机制，大多发生在丝氨酸(serine, S)，苏氨酸(threonine, T)或酪氨酸(tyrosine, Y)三个残基上[21]。MEF2A蛋白共含有71处磷酸化位点，其中serine磷酸化位点为48处，这表明MEF2A蛋白在蛋白激酶的催化下，能够转移更多ATP或CTP磷酸基团到底物蛋白氨基酸残基，促进细胞内部信号转导和相关转录因子表达。Chen等[22]研究显示，蛋白激酶B2(AKT2)能够通过EndoG-MEF2A信号诱导心肌细胞的体积减小，其缺乏会造成心肌细胞发育迟缓，并认为MEF2A需要与跟信号应答相关转录因子协同作用才能激活肌肉进行表达，这与本研究中对磷酸化位点进行分析所得出的结果相吻合。

亚细胞定位结果显示，该基因主要分布于细胞核、细胞质、线粒体以及分泌系统的囊泡中，且在细胞核中占比最高。细胞核是遗传信息的储存场所，DNA对转录的调节需要依靠转录因子和RNA聚合酶。功能预测表明，MEF2A蛋白在生物学过程中参与转录调节与DNA模板化，能够影响RNA聚合酶II调节区的DNA结合，这在Silva等[23]研究中有所涉及，但并未揭示其详细的调控机制。同源性能直观反映出物种间亲缘关系的亲疏性。从牦牛与普通牛、家猫、家犬、绵羊、小鼠、金钱豹等13个物种的氨基酸序列同源性比对可知，不同物种间氨基酸亲缘关系较接近，而利用MEF2A氨基酸序列构建系统进化树与动物分类观点相一致，表明MEF2A基因在漫长的物种进化过程中高度保守。

在肌肉发育过程中，MEF2基因家族成员表达具有组织特异性和发育时空性[24]。牦牛MEF2A基因的组织表达结果显示，MEF2A基因在牦牛臀肌中表达量最高，其次是心脏，在肝脏和肺脏中亦有较低的表达量。这与李善高等[25]在正常大鼠肝脏组织中得到的结果一致。高等动物个体运动主要依赖于骨骼肌的收缩。肌球蛋白作为肌细胞的重要组成部分，是细胞骨架中微丝(又称肌动蛋白丝)的主要结构，在哺乳动物细胞中能够形成细胞的收缩性结构。MEF2A基因作为肌生成过程中的重要转录因子，能够参与激活骨骼肌的修复再生[26]。冯剑等[27]通过对骨骼肌损伤修复过程中参与骨骼肌损伤后再生的生长因子进行归纳,揭示了骨骼肌生长因子、肌球蛋白重链及胶原在骨骼肌损伤修复中的作用。由此推测，MEF2A在非肌肉组织中的微量表达可能与细胞骨架中微丝的生成有关，但是具体的生命活动过程尚处未知。

4 结 论

本研究通过RT-PCR技术及生物信息学分析方法克隆分析类乌齐牦牛MEF2A基因CDS区序列，并采用实时荧光定量PCR进行组织定量分析，发现牦牛MEF2A蛋白由489个氨基酸组成，属于亲水性蛋白，且没有跨膜结构，主要存在于细胞核中；该基因在臀肌中的表达量较高，说明该基因与牦牛肌肉代谢有关。研究结果为进一步改善牦牛肉质和优质育种，探究MEF2A基因的生物学功能奠定初步的理论基础。