石斛合剂对高脂高糖糖尿病大鼠心肌细胞Ca2+代谢的影响

王海生，谢永财，李长征，林 鑫，陈佳林

（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122）

糖尿病心肌病（diabetic eardiomyopathy，DCM）早期以心肌舒张功能障碍为主，晚期则以心肌收缩功能障碍为主，最终引起各种心律失常、心力衰竭、心源性休克，甚至猝死，其发病原因可能是心肌细胞的代谢紊乱、钙稳态失衡、冠状动脉的微血管病变、心肌间质纤维化以及心脏自主神经病变。Ca2+作为心肌启动兴奋-收缩和复极-舒张两个偶联的枢纽，在正常心肌细胞内存在相对稳定的钙平衡系统，即钙稳态。钙稳态失衡，Ca2+信号失常，可导致心肌收缩、舒张功能受损。石斛合剂以滋阴、益气、活血立法，具有良好的降糖、降脂作用，可有效预防2 型糖尿病的并发症［1］。 本研究以糖尿病心肌病大鼠模型为研究对象，以肌浆网Ca2+-ATP 酶（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a）、L 型钙通道αlC亚单位蛋白（calciumchannel，voltage-dependent，L type，alpha lC subunit，CACNA1C）为指标，探讨石斛合剂对糖尿病心肌病Ca2+代谢的影响，为石斛合剂治疗DCM 提供佐证。

1 实验材料

1.1 实验动物 Wistar 大鼠，SPF 级，体质量（150±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2012-0002，合格证编号：2015000 532211。

1.2 实验药物 石斛合剂药物组成：石斛12 g，黄芪20 g，太子参15 g，丹参20 g，葛根20 g，五味子15 g。 购自福建省第三人民医院，自煎，浓缩至生药含量2.0 g／mL，灭菌分装后保存备用。 盐酸二甲双胍肠溶片，每片250 mg，购自贵州天安药业股份有限公司，批号：20160769。

1.3 实验试剂 高脂饲料（闽侯县吴氏实验动物贸易有限公司）；链脲佐菌素（上海源叶生物科技有限公司，CAS 号：18883-66-4）；SERCA2a 一抗（美国Abcam 公司）；CACNA1C 一抗（Bioss 公司）；HRP 标记山羊抗兔二抗、β-actin、GAPDH（美国Proteintech公司）；Trizol 试剂盒、cDNA 一链合成试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.4 实验仪器 NanoDrop 2000 分光光度仪（美国Thermo 公司）；9700 基因扩增仪（美国Applied Biosystems 公司）；水平电泳仪、GelDoc XR 凝胶成像仪（美国Bio-Rad 公司）；Rt2100c 酶标检测仪（美国Rayto公司）；DYCZ-24DN 双垂直电泳仪、DYCZ-40D 转印电泳仪（北京六一仪器厂）；V300 扫描仪（日本EPSON 公司）。

2 实验方法

2.1 分组及造模 选取Wistar 大鼠24 只，于福建中医药大学SPF 级实验动物中心分笼饲养，每笼5 只。 适应性喂养1 周后，随机取5 只作为正常组，予基础饲料喂养7 周后，腹腔注射2 mL 柠檬酸缓冲液，1 周内注射2 次。 余19 只大鼠采用高脂高糖饲料喂养联合链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病心肌病模型［2-3］，以高脂饲料喂养7 周后，腹腔注射链脲佐菌素15 mg／kg，1 周内注射2 次。 注射链脲佐菌素1 周后，测空腹血糖，血糖值11.1 mmol／L 以上确定为糖尿病模型。 成模大鼠随机分成3 组，即模型组、二甲双胍组、石斛合剂组，继续予高脂饲料喂养。 成模8 周后，二甲双胍组按80 mg／（kg·d）予二甲双胍溶液灌胃；石斛合剂组按6.9 g／（kg·d）予石斛合剂煎液灌胃；正常组、模型组予相同体积生理盐水灌胃。 每周灌胃5 次，4 周后，用10%水合氯醛，以0.4 mL／kg 的剂量腹腔注射麻醉，剪取左心室，冷冻备用检测。

2.2 观察指标及方法

2.2.1 大鼠血糖检测 实验结束前，禁食不禁水12 h，麻醉后，腹主动脉采血，检测血糖水平。

2.2.2 大鼠心肌病理学观察 取左心室组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明，浸蜡，包埋制成蜡块，切成厚度为5 μm 的切片，HE 染色光镜观察。

2.2.3 大鼠心肌细胞内游离钙浓度测定 参照BEUCKELMANN 等［4］方法进行改良，采用荧光分光光度计法测定心肌细胞内游离钙（calcium in cardiomyocyte，MyoCa2+）。 取100 mg 心室肌组织，荧光分光光度计测定细胞悬液荧光F（激发波长340 nm，发射波长500 nm），加入0.1%Triton X100 和2.5 mmol／L 乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），测定最大荧光值（Fmax）和最小荧光值（Fmin），计算MyoCa2+浓度。

2.2.4 RT-PCR 法测定SERCA2a mRNA 水平 取左心室游离壁组织100 mg，提取总RNA，用紫外分光光度仪检测RNA 浓度， 确定RNA 的纯度及浓度，A260／A280应在1.8～2.0 之间。 cDNA 合成及PCR扩增按南京诺唯赞生物科技有限公司的cDNA 一链合成试剂盒和PCR Mix 说明书操作。引物由上海博尚生物技术有限公司合成，SERCA2a（rat）上游引物：5’CTATGACTGGTGATGGTGTGAAC-3’，下游引物：5’GGAGATGAGGTAGCGGATGA-3’，扩增片段长度203 bp；GAPDH（rat）上游引物：5’ACGGCA AGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物：5’GAAGACG CCAGTAGACTCCACGAC-3’，扩增片段长度110 bp。使用美国Applied Biosystems 9700 PCR System，按预变性（94℃，5 min）、变性（94℃，30 s）、退火（58 ℃，30 s）、延伸（72 ℃，20 s；2→4，30 个循环；72 ℃，7 min）程序，进行扩增。 取4 μL PCR 扩增产物，经0.9%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪检测条带灰度值。

2.2.5 Western blot 检测SERCA2a 和CACNA1C 蛋白表达 取左心室游离壁组织100 mg，冷PBS 洗涤置于匀浆管中，加入蛋白酶抑制剂，进行匀浆、离心，收集上清液。 采用BCA 法测定蛋白浓度，蛋白变性后，通过SDS-PAGE 电泳及转膜，TBST 配制的5%的脱脂牛奶封闭1 h。加入SERCA2a 一抗（1∶1 000）和CACNA1C 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，PVDF膜用TBST 洗涤3 次，加入二抗（1∶10 000），室温下摇床上孵育1 h。 以ECL 试剂盒显色，在显影仪中观察相应蛋白表达量，Image-J 软件分析目标带的光密度值。

2.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行分析。 实验数据以（x±s）表示，符合正态分布用方差分析，非正态分布用秩和检验中独立样本比较。

3 结 果

3.1 4 组大鼠血糖比较 见图1。

图1 4 组大鼠血糖比较

3.2 大鼠心肌HE 染色结果 正常组心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐；模型组心肌纤维排列紊乱，纤维增粗、断裂明显；二甲双胍组心肌纤维增粗，排列尚整齐，纤维断裂较多；石斛合剂组心肌纤维排列较整齐，增粗不明显，纤维断裂较少。 见图2。

图2 4 组大鼠心肌HE 染色光镜图（×400）

3.3 4 组大鼠心肌细胞MyoCa2+含量比较 见图3。

图3 4 组大鼠心肌细胞MyoCa2+含量比较

3.4 4 组大鼠心肌SERCA2a mRNA 表达比较 见图4。

图4 4 组大鼠心肌SERCA2a mRNA 表达比较

3.5 4 组大鼠心肌SERCA2a 蛋白表达比较 见图5。

3.6 4 组大鼠心肌CACNA1C 蛋白表达比较 见图6。

4 讨 论

临床研究认为，糖尿病的病机始于痰湿阻滞、痰瘀热积，继而伤阴（夹瘀），引发糖耐量异常和2 型糖尿病，日久伤阴耗气致气阴两虚和阴阳两虚，而且多夹杂瘀血［5］。 根据此特点，按照滋阴、益气、活血的治疗原则，创立了由石斛、黄芪、太子参、丹参、葛根、五味子组成的石斛合剂，获得了良好的临床效果［1］。

图5 4 组大鼠心肌SERCA2a 蛋白表达比较

图6 4 组大鼠心肌CACNA1C 蛋白表达比较

心肌细胞钙循环主要包括钙释放、钙回摄和钙储存三个过程，任何一个环节的异常都将破坏心肌细胞的钙稳态，引起细胞内钙瞬变减小或衰减减慢，是心力衰竭时心肌收缩力下降的主要原因。 心肌细胞去极化时，肌浆网内少量Ca2+通过L 型钙通道迅速进入细胞质使得Ca2+浓度增加，Ca2+与肌浆网上的兰尼碱受体2 结合使其开放，导致大量的钙离子从肌浆网中释放出来，此过程即钙诱导钙释放［6］。 糖尿病心肌病时，L 型钙通道表达过量，导致细胞质内的Ca2+浓度过高，造成钙超载，使兴奋收缩偶联加强，心肌收缩力增强，最终引起舒张功能障碍［7］。 本研究CACNA1C 蛋白定量结果显示，石斛合剂组和二甲双胍组比较，差异虽然无统计学差异（P＞0.05），但同模型组比较，石斛合剂组CACNA1C 表达显著降低（P＜0.05），说明石斛合剂可以抑制CACNA1C蛋白表达，具有一定抑制CICR 的作用。

心肌细胞收缩后，钙离子的清除主要经肌浆网钙泵即SERCA2a［8］，将细胞质内的Ca2+回摄至肌浆网内储存，SERCA2a 在钙回摄中具有主导作用。 一般认为，糖尿病时SERCA2a 活性降低，摄取Ca2+速率减慢［9］，导致细胞质Ca2+增多，造成钙超载，心肌收缩时间延长［10］。 本研究中SERCA2a mRNA 及蛋白表达结果显示，石斛合剂组与正常组之间差异无统计学意义（P＞0.05），但同模型组与二甲双胍组比较，均呈显著性增高（P＜0.05），说明石斛合剂可以增加SERCA2a mRNA 和蛋白表达，提升摄取Ca2+的速率，降低细胞质Ca2+负荷，缓解钙超载。 MyoCa2+测定也显示，石斛合剂组心肌细胞内游离钙较模型组显著性较低（P＜0.01），同二甲双胍组比较明显降低（P＜0.05）。心肌HE 染色光镜观察结果同样显示，石斛合剂组心肌纤维排列明显较模型组、二甲双胍组整齐，纤维断裂也极少发生。

石斛合剂对心肌细胞的保护作用，除了纠正钙稳态失衡之外，是否降糖作用也是途径之一？ 但血糖值对比显示，石斛合剂组与模型组比较，有明显降糖作用（P＜0.05），但不及二甲双胍组（P＜0.05），说明石斛合剂保护心肌细胞的作用不在于降糖作用。

综上所述，石斛合剂对心肌细胞保护的途径在于抑制CACNA1C 表达，减缓钙诱导钙释放，防止肌浆网内的Ca2+过多过快的进入细胞质；更重要的是通过促进SERCA2a 表达，增加肌浆网钙泵对钙的回摄，起到防止心肌细胞钙超载，有效预防糖尿病心肌病的发生。