肾病及相关疾病患儿EB病毒DNA检测分析*

江杨华 宋 然 李 艳 林应标

湖南省郴州市第一人民医院 1 检验医学中心 2 血管外科 423000

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是疱疹病毒的一种，在人群的感染非常普遍，在各个年龄阶段均存在不同程度的感染，且年龄不同，引起的疾病谱差异较大。中老年人，EBV引起的恶性淋巴组织增生性疾病发病率高，包括预后不佳的慢性活动性EBV感染、恶性淋巴组织增生性疾病及肿瘤[1]等；青少年感染EBV后，大部分表现为传染性单核细胞增多症，少部分可异位感染T淋巴细胞、上皮细胞及NK细胞等[2]，也可引起慢性EBV感染，干扰免疫功能，导致细胞免疫功能紊乱；EBV的原发感染多发生在儿童期，临床上可表现为无明显症状、传染性单核细胞增多症或引起非典型EBV感染，累及全身各个系统(呼吸道感染性疾病、消化系统疾病、血液系统疾病、泌尿系统疾病等)，症状多样，程度轻重不一[3-4]。

儿童肾病及相关疾病的病因复杂，影响因素较多，往往是多种因素共同作用的结果。由于EBV感染的隐蔽性(症状不明显)，在缺乏经典临床特征的情况下，医生最初往往不会考虑EBV感染，使得诊断出现偏差和治疗效果欠佳。为了解EBV与肾病及相关疾病的关系及对疾病进展的影响，本研究回顾性地分析了该类患者EBV感染及病毒DNA载量水平情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象及样本采集 收集2018年7月—2019年6月期间在我院儿童肾内科住院患儿435例为测试组，其中男288例，女147例，年龄9个月～14岁。按照小儿肾病诊断标准[5-7]，可分为101例肾病综合征患儿，102例急性肾小球肾炎患儿和232例过敏性紫癜患儿，排除血液病和免疫缺陷病小儿。同时收集同一时期本院正常体检儿童103例，男62例，女41例，年龄10个月～14岁，作为对照组。所有儿童用EDTA-K2抗凝管采集静脉血2ml。

1.2 仪器与试剂 EBV DNA的检测仪器采用美国应用生物系统公司的ABI7500荧光定量PCR仪，试剂采用湖南圣湘生物科技有限公司的EBV核酸荧光定量检测试剂盒。

1.3 EBV-DNA抽提 严格按照试剂说明书分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)。过程如下：先取0.8ml全血样本进行PBMC的分离，再将分离到的PBMC的数量调整至终浓度为1×105个/ml，稍离心后加入400μl核酸释放剂充分混匀，75℃恒温处理10min后，瞬时离心作为PCR扩增模板备用。

1.4 检测方法 EBV-DNA的检测采用实时荧光定量PCR方法进行，PCR反应体系和反应条件参照试剂说明书。载量≥100copies/ml以上者，定为阳性，反之定为阴性。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析。EBV-DNA载量呈非正态分布，用中位数表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，EBV-DNA阳性率之间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾病及相关疾病患儿EBV感染情况 肾脏及相关疾病患儿EBV感染情况如表1所示：测试组的总阳性率为53.56%，明显高于对照组的26.21%(χ2=24.946，P=0.000)，测试组EBV阳性患者病毒载量明显高于对照组(Z=-2.725,P=0.006)；而测试组男女之间EBV的阳性率和病毒载量差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 肾病及相关疾病患儿EBV感染情况比较

注：男女阳性率差异比较：χ2=0.211，P=0.646；男女阳性者EBV-DNA载量差异比较：Z=-0.33，P=0.974；测试组和对照组阳性率差异比较：χ2=24.946，P=0.000；测试组和对照组阳性者EBV-DNA载量差异比较：Z=-2.725,P=0.006。

2.2 不同肾病及相关疾病的EBV感染情况 不同肾脏及相关疾病中EBV阳性率及病毒载量如表2所示：不同疾病组之间，EBV的阳性率存在明显差异(P<0.05)，其中急性肾小球肾炎组的EBV的阳性率最高，显著高于过敏性紫癜组和肾病综合征组；过敏性紫癜组次之，显著高于肾病综合征组。而不同疾病之间EBV阳性者的病毒载量则差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 不同肾病及相关疾病患儿EBV感染情况

注：两两之间差异比较：①阳性率：肾病综合征与急性肾小球肾炎χ2=21.011，P=0.000，肾病综合征与过敏性紫癜χ2=4.141，P=0.042，急性肾小球肾炎与过敏性紫癜χ2=11.438，P=0.001。②阳性者EBV-DNA载量各组间没有差异。

3 讨论

儿童非典型性原发EBV感染临床表现多样，几乎可累及任何器官，肾脏是EBV感染后常累及的器官之一[5]，EBV可直接或间接参与肾损伤过程。目前有关EBV感染直接引起肾损伤的报道较少：1995年，Douglas L等[6]研究证实1例19个月龄儿童由于感染了EBV而发展为肾病综合征，并且疾病的严重程度与EBV含量密切相关；1999年，Joanne LB等[7]发现EBV的受体CD21抗原同样存在于肾近端小管细胞，且如该组织发生EBV感染CD21抗原表达会显著上调，提示EBV感染在原发性间质性肾炎炎症和损伤模式的发生和发展中起着重要的作用。EBV感染间接引起肾损伤的报道稍多：2010年，Mirna SD等[8]报道1例11岁男孩由于链球菌和EBV合并感染并同时参与了肾损伤，最后引起急性肾小球肾炎的病例；2017年，Burcu K等[9]报道了1例由于发生EBV原发性感染而引起过敏性紫癜的患者，而后并发肾病。这些都是个例报道，不具有广泛代表性，而本研究发现，肾脏及相关疾病患儿血中EBV阳性率高达50%以上，阳性率和病毒载量均明显高于正常对照组，这表明肾相关疾病患儿确实普遍存在EBV感染，且与性别无关。近年来，随着研究的深入，EBV感染与肾损伤之间关系的报道也逐渐增多，在临床中越来越引起重视。

本研究针对不同患者进行分析发现，不同肾相关疾病患儿EBV阳性率明显不同，其中急性肾小球肾炎患儿EBV阳性率最高，过敏性紫癜次之，肾病综合征最低；但EBV阳性者的病毒载量在不同组之间没有差异，这在查阅的文献中暂未发现相似报道。其中的原因，我们推测：EBV感染一般发生于免疫力低下患儿，在肾相关疾病患儿中同样如此；且EBV在肾相关疾病患儿的感染和致病不是孤立存在，常常与其他病原体协同起作用，加快或加重病程。急性肾小球肾炎和过敏性紫癜均与病原微生物感染有关，感染后患儿免疫力受损，甚至发生免疫紊乱，肾病综合征患儿的免疫力更是长期受损，这都增大了EBV感染或再次激活复发的概率，从而影响疾病进展。

本研究还发现，有一些病情反复发作的患儿，如肾病综合征，EBV感染存在多次被检测出阳性的现象，这说明患儿EBV感染后，EBV会在体内很长一段时间一直存在，很难彻底清除，但含量会有所波动，免疫力增强时病毒含量会下降，免疫力下降时，病毒含量又会上升，或是由于肾病患儿抵抗力相对较差，反过来又增加了EBV再次感染的概率。这种复杂的情况干扰了医生的判断，增加了临床诊断的难度。

总之，儿童非典型性原发EBV感染在肾相关疾病中普遍存在，且在疾病进展中起着一定的作用；EBV常常伴随着其他病原体一并感染，且病毒感染机体后在免疫低下的患者血中会长期存在。因此，为了提高肾相关疾病诊断的及时性和准确性，应将EBV-DNA作为一种常规项目进行检测，考虑病因时应将EBV感染和其他因素一起综合分析。