CCL2及其信号通路在类风湿性关节炎和牙周炎病理机制中作用的研究进展

张林

天津医科大学口腔医院，天津300070

类风湿性关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病，病变特征是慢性滑膜炎、血管翳形成以及关节软骨和骨质破坏，最终导致关节畸形。牙周炎是一种侵犯牙周组织的慢性炎症性破坏性疾病，病变特征为牙周袋形成、袋壁炎症、牙槽骨吸收和牙齿逐渐松动，是导致成人牙齿丧失的主要原因。流行病学调查发现，类风湿性关节炎和慢性牙周炎密切相关，类风湿性关节炎患者同时罹患慢性牙周炎的概率较高，两者往往伴随出现，治疗牙周炎有助于改善类风湿性关节炎的临床症状。由此推测，类风湿性关节炎与牙周炎的发病机制可能具有一定相关性。有研究表明，白细胞被趋化聚集至关节炎症部位对类风湿性关节炎滑膜炎症反应具有重要作用，而单核/巨噬细胞被趋化聚集是牙周炎中牙周组织炎症性破坏的一个重要环节，结果提示趋化因子参与了类风湿性关节炎和牙周炎的病理过程。趋化因子是一类具有相似分子结构的超家族趋化性细胞因子，能够趋化细胞定向移动，在免疫器官和免疫细胞发育、免疫应答过程、炎症反应等病理生理过程中发挥重要作用。CC族趋化因子2(CCL2)是最早被发现且被广泛研究的趋化因子家族成员，对单核细胞、记忆T细胞等具有较强的趋化作用，能够激发炎症与免疫反应。有研究报道，类风湿性关节炎和牙周炎患者均存在CCL2表达异常改变，这可能与二者病理改变密切相关。本文结合文献就CCL2及其信号通路在类风湿性关节炎和牙周炎病理机制中作用的研究进展作一综述。

1 CCL2概述

趋化因子是一类具有相似分子结构的超家族趋化性细胞因子，相对分子量为8～10 kD，具有募集、活化特定白细胞的功能，对炎症反应的启动和维持具有重要作用。根据N端半胱氨酸残基的位置和数目不同，将趋化因子分为C、CC、CXC、CX3C四个亚家族，以CC、CXC亚家族最为常见。四个亚家族趋化因子的一级结构相似，氨基酸序列具有一定同源性。趋化因子能够选择性地调控多种白细胞亚群募集和运输，还参与调控B细胞和T细胞发育、树突状细胞成熟，调控Th1、Th2型免疫应答，广泛参与炎症反应与免疫调节。

CCL2是趋化因子CC亚家族成员之一。CCL2基因定位于人染色体17q11.2～q21上，包含3个外显子和2个内含子。人类CCL2的前体蛋白包含23个氨基酸残基组成的信号肽序列和76个氨基酸残基组成的成熟分子，在翻译后加工过程中信号肽解离，因此成熟的CCL2蛋白由76个氨基酸残基构成。在机体中，CCL2可由多种细胞分泌，如内皮细胞、成纤维细胞、单核细胞等，通过与其相应受体结合，趋化中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞向病变部位聚集，还可诱导IL-2、IL-6、细胞黏附分子等细胞因子合成，从而在炎症性疾病、免疫性疾病、肿瘤等发生、发展过程中发挥重要作用。

2 类风湿性关节炎和牙周炎病理机制中CCL2及其信号通路

CCL2能够趋化单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等，使各种炎症细胞向病变部位定向迁移，使炎症细胞被募集至炎症部位，从而发挥相应的生物学功能[1，2]。类风湿性关节炎和牙周炎均为慢性炎症反应性疾病，其特征性病理变化是滑膜组织和牙周组织持续性炎症浸润。类风湿性关节炎中的巨噬细胞、滑膜成纤维细胞、内皮细胞和软骨细胞均能够分泌CCL2，而CCL2能够趋化单核细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润聚集至炎症部位，启动和扩大炎症反应，从而导致滑膜组织持续性破坏[2]。类风湿性关节炎患者血清、滑膜液和滑膜组织CCL2表达明显升高；在胶原诱导性关节炎模型中CCL2拮抗剂能够抑制巨噬细胞趋化聚集，减轻滑膜炎症程度。在牙周炎组织中CCL2表达明显升高[3]。有研究报道，在牙周炎症活跃处CCL2表达明显升高，CCL2能够调控白细胞整合素，通过微循环聚集单核细胞、巨噬细胞，从而趋化单核细胞、巨噬细胞浸润聚集至炎症部位，促进牙周组织持续性炎症反应。CCL2还是一个与破骨细胞基因有关的趋化因子，能够促进人破骨细胞前体分化为破骨细胞。CCL2通过与在破骨细胞前体上表达的CCR2结合，促进破骨细胞生成，导致牙槽骨组织破坏[4]。因此推测，CCL2可能是类风湿性关节炎中滑膜炎症反应和牙周炎中牙周组织炎症反应的关键趋化因子，其在这两种疾病炎症反应中可能存在相似的调控机制[5]。

2.1 类风湿性关节炎病理机制中CCL2及其信号通路

有研究报道，在Ⅱ型牛胶原诱导性关节炎大鼠膝关节滑膜组织中CCL4通过激活CCL4/CCR5/c-Jun和c-Fos/CCL2信号通路上调CCL2表达，从而趋化单核细胞、巨噬细胞浸润聚集至关节炎症组织[6]。配体CCL4会与在白细胞表面上表达的CC族趋化因子受体5(CCR5)结合，CCR5的G蛋白会促进二磷酸鸟苷转换成三磷酸鸟苷。在类风湿性关节炎活动期，G蛋白解离成Gα和Gβ亚单位，后者激活细胞膜相关的磷脂酶C-β2(PLC2)，PLC2会分解4，5-二磷酸脂酰肌醇形成细胞内第二信使——1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)。IP3调动Ca2+在细胞内储存，DAG与Ca2+结合后激活蛋白激酶C(PKC)。PKC的激活和(或)细胞内Ca2+对富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(PYK2)的激活是必须的、充分的。PYK2通过调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的亚族c-Jun N末端蛋白激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)活性，促进激活蛋白1(AP-1)的DNA通过c-Jun和c-Fos与CCL2基因的启动子结合。在Ⅱ型牛胶原诱导性关节炎大鼠膝关节滑膜组织中，c-Jun和c-Fos表达升高。AP-1的c-Jun和c-Fos分别被JNK和p38 MAPK磷酸化。被JNK和p38 MAPK激活的关键转录因子之一是AP-1。AP-1的结合位点在许多类风湿性关节炎相关基因的启动子区域。因此，在Ⅱ型牛胶原诱导性关节炎大鼠中通过JNK和p38 MAPK/c-Jun和c-Fos信号通路调控下游CCL2基因表达。在Ⅱ型牛胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织中CCL4表达升高，通过激活CCL4/CCR5/c-Jun和c-Fos/CCL2信号通路，最终使CCL2表达升高。低能量激光照射能够降低Ⅱ型牛胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织中CCL4表达，通过抑制CCL4/CCR5/c-Jun和c-Fos/CCL2信号通路，使CCL2表达降低。抑制Ⅱ型牛胶原诱导性关节炎大鼠膝关节组织CCL2生成，能够减少白细胞浸润，抑制关节组织破坏。

在类风湿性关节炎患者滑膜组织中AP-1 DNA结合活性明显升高，骨桥蛋白刺激外周血单核细胞会促进AP-1与CCL2基因启动子结合，从而使CCL2表达升高。AP-1是CCL2的上游基因，c-Jun和c-Fos同时表达升高会提高AP-1的结合活性。AP-1表达升高与类风湿性关节炎滑膜增生、局部免疫功能紊乱等密切相关[7]。我们在前期研究中证实，类风湿性关节炎患者膝关节滑膜组织和外周血白细胞CCL2表达升高，通过CCL4/CCR5/c-Jun和c-Fos/CCL2信号通路促进类风湿性关节炎慢性炎症反应[8]。

2.2 牙周炎病理机制中CCL2及其信号通路

2.2.1 牙周炎病理机制中CCL4/CCR5/c-Fos和c-Jun/CCL2信号通路 AP-1在激活炎症反应、血管生成和动脉粥样硬化形成等病理生理过程中具有重要作用。在炎症反应过程中，AP-1能够调控许多细胞因子和趋化因子表达。牙周病原菌会使全身循环系统中AP-1水平升高。因此，牙周炎与具有炎症反应特征的全身系统性疾病密切相关，如心血管疾病、类风湿性关节炎、糖尿病等[9～11]。序列分析显示，NF-κB、AP-1等转录因子的结合位点在CCL2基因的5′端上游区，AP-1结合位点在编码趋化因子基因的启动子区域反复出现，而AP-1结合位点是CCL2转录调控表达的重要位点。Wang等[12]研究指出，人血管内皮细胞中AP-1蛋白高表达可诱导CCL2表达增加。c-Jun是AP-1激活的主要因素，而c-Fos介导的AP-1活性增加是因为形成了c-Jun和c-Fos异型二聚体，这种异型二聚体较c-Jun和c-Jun同型二聚体在与DNA结合和转录调控方面更加有效。近期研究发现，实验性牙周炎大鼠牙龈组织和外周血白细胞CCL2、CCL4、CCR5、c-Jun、c-Fos mRNA和蛋白高表达，推测c-Jun和c-Fos以异型二聚体形式形成AP-1复合体，能够促进CCL2高表达；龈下刮治和根面平整术后，实验性牙周炎大鼠牙龈组织和外周血白细胞中CCL2、CCL4、CCR5、c-Jun、c-Fos mRNA和蛋白表达降低，表明抑制AP-1激活能够降低实验性牙周炎大鼠牙龈组织和外周血白细胞中CCL2表达。由此推测，实验性牙周炎大鼠CCL2表达变化可能是通过CCL4/CCR5/c-Fos和c-Jun/CCL2信号通路调控实现的。

MAPK信号通路能够调控与炎症反应相关的AP-1活性。前炎症因子在不同细胞中会激活不同的MAPK家族成员，如细胞外信号调节酶(ERK)、p38 MAPK、JNK。这3种MAPK亚族均参与了类风湿性关节炎的病理过程[13]。有研究报道，前炎症因子在滑膜成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、牙龈组织成纤维细胞中均能够上调c-Fos、c-Jun mRNA表达，增加AP-1-DNA的结合活性。MAPK磷酸化可激活信号通路下游的转录因子，如Elk-1、c-Jun、ATF2、CREB，继而上调AP-1中c-Fos、c-Jun表达。ERK、JNK和p38 MAPK磷酸化促进c-Fos基因转录增加，而c-Jun基因转录主要通过自身的控制。MAPK信号通路通过增加AP-1的组成成分c-Fos、c-Jun表达或直接刺激AP-1活性。AP-1包括转录因子c-Fos和c-Jun，以碱性亮氨酸拉链转录因子DNA结合区为特征。AP-1蛋白与DNA结合以Jun-Jun同型二聚体、Jun-Fos异型二聚体的形式激活而发生转录。细胞因子刺激后，AP-1蛋白可以结合至其下游基因(如CCL2)的启动子区，从而激活各种目标基因转录，同时通过Jun、Fos表达改变和蛋白磷酸化的转录后修饰，调控AP-1的功能。

2.2.2 牙周炎病理机制中CCL4/CCR5/p38 MAPK/NF-κB/CCL2信号通路 我们前期研究发现，在慢性牙周炎患者外周血白细胞中CCL2、CCL4、CCR5、NF-κB mRNA表达明显升高，血清中CCL2表达亦升高，推测慢性牙周炎患者外周血白细胞中CCL2表达升高可能是通过CCL4/CCR5/p38 MAPK/NF-κB/CCL2信号通路调控实现的[14]。

CCL2基因的5′端上游区有许多转录因子，如NF-κB、Sp-1、AP-1。在牙周炎发病过程中，脂多糖(LPS)具有重要作用。研究发现，伴放线放线杆菌的LPS能够通过上调巨噬细胞NF-κB p65表达和磷酸化，激活NF-κB通路。McDonald等[15]研究指出，LPS激活中性粒细胞NF-κB的作用是快速的、短暂的。牙龈卟啉单胞菌和大肠杆菌提取的高浓度LPS可以增加NF-κB的DNA结合活性。这些研究结果提示，慢性牙周炎患者外周血白细胞中NF-κB对CCL2的表达调控具有重要作用。

我们前期研究发现，在慢性牙周炎患者外周血白细胞中CCL4通过CCL4/CCR5/p38 MAPK/NF-κB/CCL2信号通路调控CCL2表达[14]。CCR5与配体CCL4结合引发一系列信号反应，激活PYK2，PYK2又可激活MAPK信号通路中的JNK、p38 MAPK，最终导致NF-κB被激活。p38 MAPK和JNK都不会直接磷酸化NF-κB，然而抑制这两条信号通路中的任何一条，都会显著降低NF-κB转录控制型细胞因子的启动子。Carter等[16]研究发现，p38 MAPK可通过激活TFIIB、TATA结合蛋白等基础转录因子来激活NF-κB。NF-κB可直接与TFIID复合物的TATA结合蛋白发生反应即支持上述观点。这个信号通路与IKK激活NF-κB活性的通路明显不同，见图1。

图1 CCL4/CCR5/p38 MAPK/NF-κB/CCL2信号通路示意图

相同的细胞信号可以激活JNK或p38 MAPK通路，也可以激活NF-κB转录因子。比较经典的NF-κB信号路径是细胞外界刺激激活IкB激酶(IKK1、IKK2)，磷酸化IкB，使其降解，随后NF-κB进入到细胞核中，导致各种细胞因子和前炎症因子发生转录。

有研究报道，c-Jun、c-Fos可以通过保守结构域与NF-κB p65一起通过кB和AP-1增强其与DNA的结合及其生物学功能。MAPK通路是可以调控趋化因子表达变化的转录因子AP-1、NF-κB的上游信号，而AP-1和NF-κB可以交叉耦合转录趋化因子CCL2。细胞中NF-κB诱导激酶(NIK)高表达能够激活IKK-1、IKK-2。有研究显示，p38 MAPK信号通路上游激发信号有丝分裂原/细胞外信号调节激酶激酶1(MEKK1)通过激活IKK来调控NF-κB转录。MEKK1可以直接与IKK-1、IKK-2发生反应或磷酸化IKK-1、IKK-2，而p38 MAPK的调控目标可以直接是IKK的下游信号NF-κB p65。

在CCL2的5′端上游区有NF-κB、Sp-1、AP-1等转录因子的结合位点。因此，CCL2基因转录需要NF-κB、AP-1或NF-κB与AP-1的共同作用，具体是哪种转录因子起作用取决于发生反应的细胞类型和不同的刺激源。因此，MAPKs/AP-1信号通路、p38 MAPK/NF-κB信号通路、IKKs/IкB/NF-κB信号通路中的任何一条都可调控趋化因子表达，从而在牙周炎和类风湿性关节炎中上调CCL2表达。但目前尚不清楚这三条信号通路是否平行还是拥有部分共同通路来发挥作用。

有研究报道，在类风湿性关节炎患者单核细胞中NF-κB能够调控CCL2表达[17]。调控CCL2表达的信号通路相关的趋化因子CCL4及其受体CCR5和转录因子c-Jun、c-Fos、NF-κB在类风湿性关节炎和牙周炎组织中的表达均发生改变。因此，从CCL2表达和调控其表达的信号通路来说，类风湿性关节炎和牙周炎这两种以慢性炎症反应为特征的疾病在病理方面有一定相似性。此外，CCL2还与许多全身系统性疾病密切相关，如红斑狼疮[18]、糖尿病[19]、阻塞性肺纤维化[20]、肿瘤[21]、骨性关节炎[22]、迟发型过敏反应[23]等。龈沟液、唾液、血清中CCL2水平能够反映口腔疾病与这些全身系统性疾病的关系。

牙周炎和类风湿性关节炎的病理机制相似，许多趋化因子参与这两种疾病的病理过程。CCL4/CCR5/c-Jun和c-Fos/CCL2信号通路可能是这两种慢性炎症性疾病共同的信号通路，该信号通路通过调控CCL2表达，与其他因素共同破坏牙周组织和关节组织。通过调控该信号通路降低CCL2表达，减少炎症细胞在牙周组织和关节组织的聚集，能够抑制牙周组织和关节组织破坏。因此，抑制调控CCL2表达相关的信号通路有可能为牙周炎和类风湿性关节炎治疗提供新的思路。