SORL1基因多态性与新疆维吾尔族和汉族患阿尔兹海默病的相关性

王晓蓓,再图那木·麦麦提明,马衣日木·赛买提,哈斯也提·依不来音,白 睿

(新疆医科大学第二临床医学院,第二附属医院神经内科,乌鲁木齐 830063;*通讯作者,E-mail:3236321936@qq.com)

阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病[1],发生于老年和老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损坏为特征的中枢神经系统退行性病变,AD是老年期最常见的痴呆类型,约占老年期痴呆的50%-70%[2,3],发病危险因素包括:老龄、阳性家族史、携带载脂蛋白Eε4(apolipoprotein Eε4,Apo Eε4)等位基因,研究还发现分拣蛋白相关受体-1(SORL1)基因增加晚发型AD的患病风险[4],但SORL1等位基因并非AD发病的充分必要条件,还有其他危险因素参与了AD的发生。本研究通过对散发的AD患者SORL1基因多态性检测,探索SORL1基因与新疆维吾尔族和汉族患阿尔茨海默病患者之间的相关性及民族之间的差异,为临床早期诊断阿尔茨海默病提供依据。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

收集来自2016-08～2018-06在新疆医科大学第二附属医院临床脑科中心就诊的及乌鲁木齐周边地区医院就诊的符合精神疾病的诊断和统计手册(DSM-Ⅳ)诊断标准的在新疆地区居住时间超过10年的维吾尔族AD患者和汉族AD患者,排除标准:抑郁症引起的假性痴呆,其他神经系统疾病、系统性疾病和物质中毒所引起的痴呆,正处于心、血管、肺、肝、肾等重大躯体疾病急性期的患者。收集AD患者131例,年龄≥65岁,均为散发性,其中维吾尔族72例,男性35例,女性37例;汉族AD 59例,男性26例,女性33例。同期选择与病例组年龄、性别、生活环境及方式、民族习俗相匹配的非AD患者或健康志愿者做对照组,共128例,其中维吾尔族63例,男性28例,女性35例;汉族65例,男性25例,女性40例。病例组与对照组之间性别、年龄、族别差异无统计学意义(见表1)。

表1 AD组与对照组一般临床资料比较

Table 1 Characteristics of the included subjects

组别男/女(例)年龄(岁)汉族/维吾尔族(例)病例组61/7074.40±7.92159/72对照组53/7575.20±7.58765/63χ2/t3.710.6730.467P0.0540.4130.494

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 全部病人及健康对照组采集外周静脉血3 ml。

1.2.2 基因组DNA的提取 全血提取基因组DNA使用TIANamp Genomic DNA kit提取试剂盒(北京天根生物技术公司)。严格按照说明书操作。

1.2.3 SORL1基因测定 PCR技术及DNA测序检测SORL1基因,研究中SNP基因座信息来自于公共数据库NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) GeneBank数据库,查询基因SORL1基因标准序列。引物序列参数见表2,委托北京博淼生物科技有限公司完成通过连接酶检测一聚合酶链反应(LDR-PCR)方法对2个候选SORLl基因多态位点进行基因分型。

表2 SORL1基因多态性位点引物和PCR序列

Table 2 SNP site, primer names and PCR primer sequences

位点引物名称 PCR引物序列rs37818342nd-PCRPACGTTGGATGGGAACTGGAATCCATGTCTC1st-PCRPACGTTGGATGACTGACAAGGAGGTACT-GTGUEP-SEQCCATGTCTCCCATTTTCTrs37818362nd-PCRPACGTTGGATGGAATAAGAAGCTTGAGC-CAG1st-PCRPACGTTGGATGCAACACCCTGCTTTCAACTGUEP-SEQTGAGCCAGAACATAAATCAA

1.3 统计学分析

1.3.1 一般资料统计学分析 实验为病例对照,年龄为计量资料,符合正态分布,两组比较采用t检验。性别及族别为计数资料,采用χ2检验。

1.3.2 H-W吻合度检测 为评估病例组和健康组样本是否随机及调查资料的可靠性,进行H-W吻合度测验。

1.3.3 基因频率及基因型统计学方法 基因频率和基因型的分布采用基因计数法,基因型资料采用Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度检验,计数资料以例数和率(%)表示,采用SPSS21.0进行统计学分析,两组间相互比较采用χ2检验和(或)Fisher精确概率法。P<0.05表示差异有统计学意义。多位点关联分析,使用多重检验Bonferroni校正。

2 研究结果

2.1 Hardy-Weinberg检验

经Hardy-Weinberg遗传平衡定律的吻合度法检验后,结果表示,SORL1基因型位点的观望值和期望值之间无统计学意义(P>0.05),病例组与对照组基因型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡,吻合度良好(见表3)。

表3 AD病例组与对照组基因多态性检测结果

Table 3 Results of polymorphism test between AD group and control group

基因位点n基因型等位基因GGGAAAGAHWE(P)基因位点n基因型等位基因AAAGGGAGHWE(P)rs37818340.6596rs37818360.6499病例1314379045217病例1315448054204对照1287368550206对照1288417857197

HWE:Hardy-Weinberg平衡定律吻合度检验

2.2 SORL1基因多态性分析

维吾尔族、汉族病例组分别与对照组比较发现SORL1基因rs3781834位点基因型为GA型,rs3781834位点基因型为AG型(见表4)。

表4 AD组与对照组基因型及等位基因分布

Table 4 Genotypic and allelic distribution in AD group and control group

基因位点组别基因型χ2P等位基因χ2P rs3781834GGGAAAGA 汉族病例组322341.670.4328900.190.66对照组720383496 维吾尔族病例组115561.600.45171270.050.82对照组0164716110 rs3781836∗AAAGGGAG 汉族病例组321341.670.4327890.200.65对照组719383395 维吾尔族病例组223460.300.86271150.0000.99对照组1224024102

*rs3781836基因多态性检测中汉族病例组及汉族对照组、维吾尔族病例均有1例未检出,因此各少1例

SORL1基因的rs3781834位点的基因型分布,汉族AD组与对照组比较,维吾尔族AD组与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05,见表4)；rs3781834等位基因G和A在维吾尔族AD患者与汉族AD患者中分布差异有统计学意义(P<0.016 7,见表5)。rs3781836位点的基因型和等位基因分布各组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05,见表4,5)。

表5 维吾尔族和汉族AD患者基因型及等位基因分布

Table 5 Genotypic and allelic distribution in AD patients in Uygur and Han populations

组别rs3781834基因型rs3781834等位基因rs3781836基因型rs3781836等位基因GGGAAAχ2PGAχ2PAAAGGGχ2PAGχ2P维吾尔族115560.870.65171276.480.01223460.780.67271150.700.40汉族 322342890321342771

*rs3781836基因多态性检测中汉族病例组及汉族对照组、维吾尔族病例均有一例未检出,因此各少一例

2.3 AD患者SORL1基因rs3781834、rs3781836等位基因分布情况

散点图是根据DNA产物峰面积大小计算得到SNP位点所有分型点状图，SORL1基因rs3781834、 rs3781836等位基因正常聚类图中2个纯合子分型根据产物峰高分别在靠近横、纵轴聚类，在二者之间单独聚类的一组为杂合子(见图1，2)。根据散点图rs3781834、rs3781836聚类良好。

3 讨论

SORL1基因位于11号染色体上(11q24.1),它所编码的蛋白是一种脂蛋白受体同源体,apoE受体主要在中枢神经系统内表达,大脑皮质的锥体细胞、海马、小脑的浦肯野细胞也有表达。SORL1基因变异可明显增加晚发型阿尔兹海默病的患病风险。已经有报道，在研究AD的遗传危险等位基因的多种假定中均提示SORL1是与AD发生有关联的并排前10名的基因。基因组学数据显示52个SORL1基因位点中,29个位点与阿尔茨海默病患病密切相关,SORL1基因位点中与加勒比海地区的西班牙人、非裔美国人和个别白种人的相关性可分别达到98%,90%,53%[5.6]。虽然这些基因与AD发病的生物学机制相关,但仍需要在大量人群中反复验证[7]。许多研究都将SORL1基因的常见和罕见变异与AD联系起来[7-10],不同的变异在不同的研究中是相关的,从小的修饰影响到因果影响范围不等。El Bitar等[11]在沙特阿拉伯AD患者中研究发现SORL1在家族和散发的AD中均起到一定的作用。以65岁为界限,AD可分为早发型(early-onset Alzheimer’s disease,EOAD)和晚发型(late-onsets Alzheimer’s disease,LOAD),以后者为主,约占95%,本研究的AD患者均为晚发型患者,这与AD的流行病学相符。我们首次分析了新疆维吾尔族人群中SORL1基因rs3781834,rs3781836与AD的相关性。结果提示SORL1基因多态性位点rs3781834、rs3781836与新疆地区AD患者无明显相关性。然而Wen等[12]的研究发现,19个SNP位点中rs985421、rs12364988、rs4598682、rs3781834、rs3781836是与LOAD相关的。一项超大规模涉及到30 000名受试者的研究,跨种族的包括白种人和亚洲人的meta分析中,也证明SORL1与LOAD相关[13]。一项关于晚发型LOAD的研究发现rs2070045、rs2282649和rs3834968三个基因变异可使中国北方人和欧洲人群患AD的风险增高，这三种基因变异具有显著的遗传效应，可以调节人脑组织中SORL1的表达[14]。LOAD的发病率及基因频率具有种族差异性,因此这一结论需要在其他人群中进行验证[15]。张玉洁等[16]研究中对SORL1基因的rs2070045及rs3824968位点进行分析,发现rs2070045及rs3824968可能和新疆哈萨克族及汉族AD患者无相关性,经民族分层后仍未发现相关性。本研究经过民族的分层后发现rs3781834等位基因GG、GA、AA在维吾尔族AD患者与汉族AD患者比较中差异有统计学意义,这可能与新疆少数民族和汉族人种不同的遗传背景、生活方式、饮食习惯有关。但需大样本的、多中心的研究进一步证实rs3781834基因型多态性在不同民族的患者之间存在差异。近年来阿尔兹海默病相关的多项研究中研究对象为国外人群,部分有多中心跨种族的大型研究,国内阿尔兹海默病主要以中国南方地区的为主,新疆人群相关研究较少,地域因素也可能是导致患者发病的原因之一[7],但这需要进一步大规模、跨种族的、多中心的研究来证实。

*No Call:未发现等位基因的病例个数图1 rs3781834 GG、GA、AA等位基因位点散点图Figure 1 Scatter map of alleles at the rs3781834 site

*No Call:未发现等位基因的病例个数图2 rs3781836 AA、AG、GG等位基因位点的散点图Figure 2 Scatter map of alleles at the rs3781836 site

总而言之,在我们的样本中未发现SORL1基因的2个位点与AD相关,可能原因:①AD发生机制比较复杂,不能用单一因素解释SORL1基因与新疆地区AD患者之间的相关性;②可能因为我们实验的局限性,希望未来有大样本的、多中心的、不同人群中AD遗传基因的差异研究。