激活PPAR-γ对妊娠高血压大鼠模型ET-1/ETAR信号通路的影响

石紫云,张 雅,赵 静,刘飞飞,袁晓华

(1陕西省人民医院产科,西安 710068;2陕西省人民医院检验科,西安 710068;*通讯作者,E-mail:PurClShi@163.com)

妊娠高血压(pregnancy-induced hypertension,PIH)简称妊高征,是一种妊娠孕妇特有的一种常见疾病[1,2]。妊娠高血压可严重影响孕妇和胎儿的生命健康,对孕妇及胎儿的肾脏、心脏和大脑等多种器官均可造成损伤,严重时可造成孕妇和胎儿死亡。因此,妊娠高血压的早期诊断具有重要意义。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)是核激素受体超家族的配体激活的转录因子,包括PPAR-α、PPAR-β和PPAR-γ三种亚型[3]。多项研究报道PPAR-γ在高血压等心血管疾病中发挥关键作用。PPAR-γ是一种核激素受体,可对血管结构产生重要影响,PPAR-γ主要通过其配体(包括噻唑烷二酮类)激活[4]。PPAR-γ活化后可通过激活下游靶标参与调节脂肪酸储存和葡萄糖代谢。据报道,敲除PPAR-γ可抑制高脂肪饮食小鼠模型脂肪组织的生成[5]。并且,PPAR-γ也参与妊娠期母体代谢和胎盘发育。

内皮素(endothelins,ET)是一种调节血管收缩和升高血压的内皮来源的收缩因子。内皮素是一种有效的血管收缩剂,内皮素的过度表达可诱发高血压、心脏病等多种疾病,并且其在妊娠期间具有重要作用[6]。内皮素-1(ET-1)是由平滑肌细胞和血管内皮细胞产生的一种参与血管功能调节的重要血管活性肽之一,包括改变血管直径、改变血流和控制基底动脉张力等[7]。内皮素受体(endothelin receptors,ETR)可在血管等许多组织中表达,主要包括ETAR和ETBR两种受体[8]。据报道,PPAR-γ可抑制ET-1信号并调节血压和内皮功能[9]。然而,目前尚不清楚PPAR-γ在妊娠高血压发病过程中对ETR表达和血管收缩的影响。因此,本研究探讨了PPAR-γ在妊娠高血压发生发展中的作用,以期为妊娠高血压的诊治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

从南京医科大学实验动物中心购买60只SD雌性大鼠和30只SD雄性大鼠,大鼠体质量为206-229 g。将雌性大鼠随机分为对照组、模型组、罗格列酮组、波生坦组,每组15只大鼠。按照雌性和雄性2 ∶1的比例将大鼠饲养在笼中进行交配,次日清晨收集大鼠阴道分泌物并进行显微镜检查,以发现精子为妊娠0天。

1.2 妊娠高血压大鼠模型的建立

对妊娠大鼠进行尾静脉注射内毒素建立妊娠高血压大鼠模型,内毒素购自美国Sigma公司。将内毒素用生理盐水稀释至浓度为1 μg/ml,模型组、罗格列酮组和波生坦组大鼠妊娠第15天后开始注射2.0 μg内毒素,分别在0,1,6,24,72 h注射。对照组大鼠注射相同体积的生理盐水。在罗格列酮组大鼠妊娠15 d后,每天按照2 mg/kg的剂量对大鼠灌胃PPAR-γ激活剂罗格列酮(成都恒瑞制药有限公司,国药准字:H20030569)。波生坦组大鼠每天以50 mg/kg剂量灌胃内皮素受体阻断剂波生坦(Actelion Pharmaceuticals Ltd.,批准文号:H20110291)。模型组大鼠从妊娠第15天到实验结束每天用10 ml/kg蒸馏水灌胃。从妊娠第12天开始,每3 d通过无创性尾动脉压测量仪测量各组大鼠的尾动脉收缩压(SBP),共检测到妊娠第21天。

1.3 血小板和尿蛋白的检测

妊娠第12天开始,每隔3 d通过注射针收集大鼠的颈动脉外周血2 ml,4 000 r/min离心10 min分离血清。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海双赢生物科技有限公司)检测各组大鼠的血小板水平。此外,分别将各组大鼠放入标准代谢笼中收集尿液,用邻苯三酚红钼比色法检测尿蛋白(南京森贝伽生物科技有限公司)。

1.4 苏木精-伊红(HE)染色

大鼠妊娠21 d后,颈椎脱臼处死大鼠,对腹部皮肤剃毛消毒,用镊子提起腹部皮肤,用组织剪先剪开一个小口并分离皮下组织、筋膜,剪开皮肤,进入大鼠子宫,剖开孕鼠子宫,取出胎盘并用10%甲醛固定,石蜡包埋制作4 μm切片,然后将切片分别用100%二甲苯Ⅰ和100%二甲苯Ⅱ洗涤10 min,梯度乙醇分别洗涤5 min,蒸馏水洗涤3 min。然后将切片用苏木精染色10 min,可见细胞核被染为蓝紫色。伊红染色6 min,蒸馏水洗涤,并进行显色。切片用梯度乙醇洗涤5 min,100%二甲苯Ⅰ和Ⅱ洗涤10 min。中性树胶封片,并在光学显微镜下观察拍照。

1.5 免疫组化检测大鼠胎盘组织中ET-1的阳性表达

切片脱蜡后用1%H2O2封闭内源性过氧化物酶,PBS洗涤并用正常血清封闭。将ET-1一抗(1 ∶1 000,美国Abcam公司)与切片在4 ℃过夜孵育,然后用PBS洗涤。向切片中加入生物素化的山羊抗兔二抗(1 ∶1 000,美国Abcam公司)室温孵育1 h,然后再次用PBS洗涤。然后DAB显色,苏木精复染,脱水、透明和封闭处理后在显微镜下观察切片。PBS代替ET-1一抗作为阴性对照。随机选择5个视野(×200)在光学显微镜下观察切片并计数阳性细胞。染色强度评分如下:无染色,0分;轻度染色,1分;中度染色,2分;重度染色,3分;0-1分为阴性表达(-);1-2分为弱阳性表达(+);3-4分为中等阳性表达(++);5-6分为强阳性表达(+++)。阳性率为阳性表达(+、++和+++)例数占总数的百分比。

1.6 RT-qPCR检测大鼠胎盘组织中PPAR-γ和ETAR的mRNA表达

大鼠妊娠21 d后,颈椎脱臼处死大鼠,对腹部皮肤剃毛消毒,用镊子提起腹部皮肤,用组织剪先剪开一个小口并分离皮下组织、筋膜,剪开皮肤,进入大鼠子宫,剖开孕鼠子宫,取出胎盘。应用Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)提取大鼠胎盘组织中的总RNA。采用Synergy Brands(SYBR)Premix Ex TaqTM试剂盒(日本Takara公司)在Applied Biosystems 7300实时PCR系统(美国Applied Biosystems公司)上进行RT-qPCR。PPAR-γ、ETAR和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的引物序列见表1。反应条件如下:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环,72 ℃延伸5 min。GAPDH作为内参基因。2-ΔΔCt法用于计算基因的相对表达量。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

引物上游 下游 PPAR-γ5′-GTCAAAGAGCGATCAGCCAACGTCG-3′5′-CGGCCATGAAGCCAATCC-3′ETAR5′-AGCGTCAGGAGCGAGTCATG-3′5′-GGCTGTTGCGTTCTGCTGTCCTCG-3′GAPDH5′-TGAAACCTCGGGTCGTGCCT-3′5′-ACAGTGCGCCACGCTAAGTAG-3′

1.7 Western blot检测大鼠胎盘组织中PPAR-γ和ETAR的蛋白表达

大鼠妊娠21 d后,颈椎脱臼处死大鼠,对腹部皮肤剃毛消毒,用镊子提起腹部皮肤,用组织剪先剪开一个小口并分离皮下组织、筋膜,剪开皮肤,进入大鼠子宫,剖开孕鼠子宫,取出胎盘。使用总蛋白提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取胎盘组织中的蛋白质,使用BCA试剂盒(碧云天生物技术公司)测量蛋白质浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜在室温下用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h。然后将膜分别与一抗PPAR-γ(1 ∶2 000,Abcam)(1 ∶2 000)、ETAR(1 ∶2 000,Cell Signaling Technologies)和GAPDH(1 ∶1 000,Abcam)在4 ℃过夜孵育。使用Tris缓冲盐水和吐温(TBST)冲洗3次。然后与二抗在室温下孵育1 h,并将膜洗涤3次。采用ECL化学发光试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行显影,GAPDH作为内参,应用Image J软件分析条带灰度值,用目的蛋白和GAPDH的平均灰度值的比值来反映蛋白的相对表达量。

1.8 统计分析

SPSS 18.0软件用于分析数据。计数数据以均数±标准差表示,采用t检验和单因素方差分析进行组间比较。计数数据表示为频数和百分比,使用非参数秩和检验进行组间比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的收缩压、血小板和尿蛋白水平

结果显示,从妊娠第12天开始,随着孕龄的增加,模型组大鼠的收缩压和尿蛋白逐渐升高,而血小板计数逐渐降低(P<0.05)。罗格列酮组和波生坦组的收缩压、血小板计数和尿蛋白在不同孕龄均与对照组无显著差异(P>0.05,见表2)。

2.2 各组大鼠胎盘组织的病理改变

对照组大鼠胎盘组织正常,未见明显病理改变。模型组大鼠胎盘组织中炎性细胞浸润明显、毛细血管充血、空泡化细胞增多。然而,波生坦组和罗格列酮组大鼠的病理改变明显减轻,血管充血和炎性细胞浸润明显减少(见图1)。

2.3 各组大鼠胎盘组织中ET-1的表达

免疫组化染色结果显示,ET-1主要在血管内皮细胞和绒毛合体滋养细胞的细胞质和细胞膜中表达。与对照组相比,罗格列酮组和波生坦组胎盘染色位置无显著差异。对照组、罗格列酮组和波生坦组胎盘组织的ET-1主要为阴性或低表达,而在模型组中主要为阳性表达。对照组、罗格列酮组和波生坦组中ET-1的阳性率显著低于模型组(P<0.05,见图2和表3)。

表2 各组大鼠的收缩压、血小板浓度和尿蛋白含量

Table 2 Systolic blood pressure, platelet concentration and urinary protein content of rats in each group

指标 分组 妊娠12d 妊娠15d 妊娠18d 妊娠21d 收缩压(mmHg)对照组103.22±4.53103.26±5.27109.42±7.26109.13±6.36模型组104.23±4.64124.27±9.22∗a133.75±8.53∗b142.32±11.25∗c罗格列酮组105.17±5.12110.36±7.54#111.64±5.37#112.29±5.37#波生坦组104.92±5.26108.33±6.51#109.65±5.25#113.32±7.44# 血小板浓度(×109/L)对照组841.24±53.22834.36±65.32837.43±56.35841.27±63.73模型组844.86±46.26588.37±74.28∗a523.85±58.62∗b421.25±54.32∗c罗格列酮组840.19±62.90837.36±65.96#841.75±56.32#846.53±61.36#波生坦组841.94±58.20838.32±57.93#843.74±61.38#844.15±61.06# 尿蛋白含量(g/L)对照组 0.22±0.05 0.21±0.03 0.21±0.03 0.23±0.05模型组 0.20±0.02 0.57±0.06∗a 0.82±0.13∗b 1.37±0.11∗c罗格列酮组 0.21±0.05 0.24±0.04# 0.26±0.05# 0.24±0.04#波生坦组 0.21±0.04 0.23±0.03# 0.24±0.03# 0.21±0.05#

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与妊娠12 d比较,aP<0.05;与妊娠15 d比较,bP<0.05;与妊娠18 d比较,cP<0.05

图1 各实验组大鼠胎盘组织的HE染色Figure 1 HE staining of rat placenta tissues in each group

图2 各组大鼠胎盘组织中ET-1的免疫组化染色Figure 2 Immunohistochemical staining of ET-1 in rat placenta tissues in each group

表3 各组大鼠胎盘组织中ET-1的阳性表达(例)

Table 3 ET-1 expression in rat placenta tissues in each group(cases)

分组阴性(-)弱阳性(+)中等阳性(++)强阳性(+++)阳性率对照组 1320013.33%模型组 325580.00%∗罗格列酮组1131026.67%#波生坦组 1221020.00%#

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.4 各组大鼠胎盘组织中PPAR-γ的表达

RT-qPCR和Western blot结果显示,大鼠妊娠21 d后,与对照组相比,模型组和波生坦组的PPAR-γ mRNA和蛋白表达水平显著降低,而罗格列酮组与对照组PPAR-γ mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,见图3)。

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图3 各组大鼠妊娠21 d后的PPAR-γ mRNA和蛋白表达Figure 3 PPAR-γ mRNA and protein expression at 21 d of gestation in rats of each group

2.5 各组大鼠胎盘组织中ETAR的表达

RT-qPCR和Western blot结果显示,大鼠妊娠21 d后,与对照组相比,模型组的ETAR mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。而罗格列酮组和波生坦组与对照组的ETAR mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05,见图4)。

与对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05图4 各组大鼠妊娠21天后的ETAR mRNA和蛋白表达Figure 4 ETAR mRNA and protein expression at 21 d of gestation in rats of each group

3 讨论

妊娠高血压的发病率约为总孕妇例数的5%-8%,是一种对孕妇和胎儿妊娠结局具有重要影响的常见妊娠孕妇特有疾病。研究发现,过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)和内皮素(ET)及其受体(ETR)的异常表达与妊娠高血压的发病机制密切相关[10-12]。本研究探讨了PPAR-γ、ET和ETR在内毒素诱导的妊娠高血压SD大鼠模型中的表达及其与疾病进展的关系。

多项研究均证实,妊娠高血压患者在妊娠过程中会出现收缩压或舒张压升高,并伴随血小板计数降低,严重时还会出现血管内皮功能障碍。此外,妊娠高血压发病过程中会导致蛋白尿的出现,从而发展为子痫前期。为此,本研究通过对妊娠大鼠进行尾静脉注射内毒素建立妊娠高血压大鼠模型,从而研究妊娠高血压的发病过程及药物治疗机制。本研究显示,从妊娠第12天开始,随着孕龄的增加,模型组大鼠的收缩压和尿蛋白逐渐升高,而血小板计数逐渐降低(P<0.05)。此外,本研究通过HE染色评价各组大鼠的胎盘组织病理改变,发现模型组大鼠胎盘组织中炎性细胞浸润明显、毛细血管充血、囊泡结构增多。表明本研究建模成功。

内皮素-1(ET-1)是一种由平滑肌细胞和血管内皮细胞产生的血管收缩剂,参与血管功能调节,包括改变血管直径、改变血流和控制基底动脉张力等[7]。内皮素的过度表达可诱发高血压、心脏病等多种疾病,并且其在妊娠期间具有重要作用[6]。内皮素受体属于G蛋白偶联受体,内皮素受体被激活后可导致细胞内钙离子的向内流动,促进平滑肌细胞收缩,从而促进血压升高。内皮素受体可分为两种亚型,ETAR和ETBR。ETAR和ETBR两种受体生物学效应存在很大差异。ETAR位于血管平滑肌细胞上,主要参与介导血管收缩和细胞增殖;ETBR位于血管内皮上,主要介导血管的舒张功能。内皮素与内皮素受体(ETR)结合可激活其下游效应因子,从而调节心血管变化[13]。ETBR可与抑制性G蛋白偶联,抑制内皮素转换酶基因表达,释放前列环素、一氧化氮等舒张因子,同时ETBR还促进内皮细胞重吸收和清除ET-1。其他研究已经证实,ETBR基因敲除可加重小鼠肺动脉高压程度[14]。因此,激活ETBR能抑制肺动脉高压形成,由于ETAR和ETBR发挥不同的生物学效应,因此本文中未涉及ETBR的研究。本研究免疫组化染色显示,ET-1主要在血管内皮细胞和绒毛合体滋养细胞的细胞质和膜中表达,并且妊娠高血压模型组大鼠胎盘组织的ET-1主要为阳性表达。另外,RT-qPCR和Western blot结果显示模型组ETAR表达明显上调。妊娠高血压大鼠模型胎盘组织中ET-1和ETAR的表达均显著上调,说明ET-1/ETAR信号通路在妊娠高血压发病过程中被异常激活。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)是核激素受体超家族的配体激活的转录因子,PPAR-γ可对血管产生重要影响,其在高血压等心血管疾病中发挥关键作用。PPAR-γ主要通过其配体(包括噻唑烷二酮类)激活[4]。敲除PPAR-γ可抑制高脂肪饮食小鼠模型脂肪组织的生成[5]。并且,PPAR-γ也参与妊娠期母体代谢和胎盘发育。本研究中RT-qPCR和Western blot结果显示,大鼠妊娠21 d后,妊娠高血压大鼠模型胎盘组织中的PPAR-γ表达水平显著降低,上述结果说明,PPAR-γ的表达在妊娠高血压胎盘中被抑制。

罗格列酮是一种噻唑烷二酮类的抗糖尿病药,罗格列酮可与脂肪细胞中的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)结合来作为胰岛素敏化剂,从而增加靶细胞对胰岛素的敏感性。文献报道,罗格列酮是一种PPAR-γ激活剂,罗格列酮通过调节PPAR-γ的表达来治疗高血压相关疾病[15]。此外,罗格列酮可以通过提高胰岛素敏感性来改善血糖控制[16]。波生坦是一种内皮素受体拮抗剂,多项临床研究均显示波生坦可有效治疗肺动脉高压。通常情况下,内皮素受体与内皮素-1结合可引起肺血管收缩。而波生坦能够有效抑制内皮素-1与内皮素受体的结合,从而有效降低肺血管阻力,从而降低血压[17]。还有研究报道,波生坦可用于治疗儿童肺动脉高压,并且疗效显著[18]。本研究发现罗格列酮组和波生坦组的收缩压、血小板计数和尿蛋白在不同孕龄均与对照组无显著差异(P>0.05)。此外,波生坦组和罗格列酮组大鼠的胎盘组织病理改变明显减轻,血管充血和炎性细胞浸润明显减少。说明罗格列酮和波生坦对妊娠高血压大鼠具有较好的保护作用。

据报道,PPAR-γ可抑制ET-1信号并调节血压和内皮功能[9]。本研究中,通过应用PPAR-γ激活剂罗格列酮治疗后,妊娠高血压大鼠胎盘组织中PPAR-γ明显上调,达到与对照组相当的水平,而ET-1和ETAR明显下调,说明了PPAR-γ可抑制ET-1/ETAR信号通路的活化,进而减缓疾病进程。另外,大鼠应用内皮素受体阻断剂波生坦治疗后,妊娠高血压大鼠胎盘组织中PPAR-γ的表达水平与未经治疗的模型组无显著差异,然而ET-1和ETAR明显下调,波生坦的治疗达到了与罗格列酮相似的效果,因此,间接证实了激活PPAR-γ通过抑制ET-1/ETAR信号通路来发挥治疗作用。

总之,在妊娠高血压大鼠模型胎盘组织中,PPAR-γ表达下调,而ET-1和ETAR上调。激活PPAR-γ可通过抑制ET-1/ETAR信号通路来降低血管收缩作用,从而抑制妊娠高血压的疾病进展。