齐墩果酸通过AMPK介导的信号通路激活自噬改善脂毒性诱导的肝细胞损伤

冯璐燕 赖尚磊 叶萤燕 张漪婷 窦晓兵 李松涛

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种以肝脏脂肪过量积聚为主要病理特征的疾病，其临床表现形式包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎，疾病可递进发展为肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等中末端肝病［1-2］。近年来伴随人们生活习惯和饮食结构的改变，NAFLD 在我国的患病率逐年增加，我国NAFLD的患病率从2013年报道的20.9%，增加至2018年的25%以上［3-4］。在NAFLD的治疗中祖国医学的疗效具有明显优势，采用中医药物治疗 NAFLD可减少肝脏脂肪沉积、改善脂质代谢紊乱及肝功能［5］。中药单体化合物齐墩果酸（oleanolic acid，OLA）主要来源于女贞子，《本草再新》中论述女贞子具有“养阴益肾、补气舒肝”的功效，杨念云等［6］研究发现女贞子可显著改善高脂饮食诱导的NAFLD。研究表明OLA具有调血脂、抗脂肪肝等功效［7］，但其作用机制尚不明确，因此，本研究以棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导Aml-12肝细胞建立肝细胞脂毒性模型，探究OLA对PA诱导肝细胞脂毒性的保护作用及潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器 Aml-12小鼠正常肝细胞株购自中国科学院（上海）细胞库；PA、雷帕霉素（rapamycin，Rap）、氯喹（chloroquine，CQ）、OLA、DMEM/F12 培养基购自Sigma公司；胎牛血清购自Gibco公司；抗LC3B及抗GAPDH抗体购自Cell Signaling公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术公司；二氧化碳培养箱（Thermo，USA）；酶标仪（MD，USA）；AllegraTM 64R低温高速离心机（Beckman，USA）；数字凝胶成像系统（Protein Simple，USA）。

1.2 方法 （1）细胞培养：Aml-12细胞培养于DMEM/F-12培养基（含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、5mg/ml胰岛素，5μg/ml转铁蛋白，5ng/ml硒，40ng/ml地塞米松）于37℃、5%CO2培养箱中进行培养。（2）细胞干预：OLA不同浓度（10、20、40、80、100μmol/L）干预细胞24h后检测细胞活力。OLA保护脂毒性实验中使用OLA干预2h后加入PA处理12h，收集培养基或细胞便于进行后续实验研究。自噬激动或抑制分别采用自噬激动剂Rap（100nmol/L）或自噬抑制剂CQ（20μmol/L）对细胞预处理1h后给予其他干预。（3）PA制备：将棕榈酸溶解在乙醇中并用氢氧化钠皂化。将钠盐干燥，重新悬浮在PBS中并在80℃下加热直至其完全溶解。当溶液仍然温热时，加入等体积的20%BSA，将混合物在50℃搅拌4h，使棕榈酸与BSA结合。然后通过使用0.2μm直径的过滤器过滤将棕榈酸-BSA（3mmol/L棕榈酸：1.5mmol/L BSA；摩尔比，2：1）除菌，并分装以备使用。（4）细胞死亡检测：乳酸脱氢酶（LDH）在培养液中的释放、Hoechst染色和MTT试验。对乳酸脱氢酶测定，收集培养基，用乳酸脱氢酶检测试剂盒（Thermo Scientific Inc，VA），按照制造商的说明指示，Hoechst染色用Hoechst 33342染色液（5mg/L）染色10min。PBS漂洗后，用荧光显微镜对细胞进行成像（Leica，Whitzlar，德国）。MTT法将细胞接种于96孔板中，密度为2×104/孔，培养至80%汇合。每孔分别加入20μl［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四氮唑，5mg/ml］。细胞在37℃下孵育4h，使MTT掺入并转化为甲醛衍生物。二甲亚砜（DMSO）对甲醛衍生物有一定的增溶作用。在室温下摇床孵育10min后，用FLUOSTAR Omega在470nm处测定吸光度值（BMG LabTech，Offenburg，德国）。（5）Western Blot：收集细胞，用PBS漂洗，加适量蛋白裂解液，放冰上30min，充分涡旋震荡后，于4℃ 12000g离心15min，收集蛋白上清液，用BCA法测定蛋白质浓度。加入上样缓冲液，100℃煮5min使蛋白变性，冷却后上样。每个样品取等量蛋白用SDS-PAGE电泳分离后，低温转移至PVDF膜，含5% BSA封闭液封闭，与相应的一抗、二抗杂交，用化学发光法及数字凝胶成像仪对图像进行拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件。对多组不同处理方式的样本，先进行方差齐性检验，方差齐时采用one-way ANOVA方法进行显著性检验统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞脂毒性模型建立 如图1A所示，给予Aml-12小鼠肝细胞不同浓度的PA进行干预，细胞释放的LDH水平显著增加（P＜0.05），并呈现剂量依赖关系，说明肝细胞损伤显著增强。Hoechst染色结果表明PA干预以剂量依赖关系增加肝细胞的细胞核损伤（图1B）。上述结果说明PA可以剂量依赖关系诱导肝细胞脂毒性，在后续研究中选择0.5mmol/L的PA作为脂毒性诱导剂量。

图1 不同浓度PA对Aml-12细胞脂毒性的影响（注：A：PA干预后细胞上清LDH含量检测；B：Hoechst染色观察PA诱导的肝细胞损伤）

2.2 OLA改善PA诱导的肝细胞脂毒性 给予Aml-12细 胞 不 同 浓 度 剂 量 的 OLA（10、20、40、80、100μmol/L）处理24h后，通过MTT法检测细胞活力，实验结果表明当OLA浓度＞80μmol/L呈现出显著的细胞毒性（P＜0.05，图2A）。因此，选择≤40μmol/L的OLA浓度进行后续研究。研究结果表明OLA干预可显著抑制PA（0.5mmol/L）诱导的肝细胞损伤（P＜0.05），并呈现剂量依赖关系（图2B、C）。

图2 OLA改善PA诱导的肝细胞脂毒性［注：A：MTT法细胞活力检测细胞；B：培养液上清LDH含量检测；C：Hoechst染色观察（400×）］

2.3 自噬调控PA诱导的肝细胞脂毒性 分别采用自噬抑制剂CQ（20μmol/L）和自噬激动剂Rapamycin（100 nmol/L）对Aml-12细胞进行预处理1h，然后给予细胞PA处理12h，检测自噬抑制或激活自噬对PA诱导的细胞损伤的影响，结果表明抑制自噬可显著加重PA诱导的细胞损伤，而激活自噬能显著改善细胞损伤情况（P＜0.05，图3A）。通过Hoechst染色观察得到与上述一致的结果，即抑制自噬显著加重了PA处理导致的胞内细胞核固缩及核小体碎片增加；而激活自噬后细胞核损伤明显改善（图3B）。

图3 自噬调控PA诱导的肝细胞脂毒性［注：A：细胞上清LDH含量检测；B：Hoechst染色观察（400×）］

2.4 OLA通过激活自噬改善PA诱导的脂毒性 随后检测了OLA对肝细胞自噬的影响，分别以10、20和40μmol/L的OLA处理Aml-12肝细胞12h，通过Western blot检测自噬标志蛋白LC3B Ⅰ/Ⅱ的表达变化，结果表明OLA能以剂量依赖关系激活LC3 Ⅱ的表达（P＜0.05，图4A），说明OLA可显著激活肝细胞自噬。给予Aml-12细胞自噬抑制剂CQ（20μmol/L）预处理1h后再给予OLA（40μmol/L）干预2h，随后进行PA处理12h，结果表明抑制自噬显著阻断了OLA对PA诱导脂毒性的保护作用（P＜0.05，图4B）。Hoechst染色观察结果一致（图4C）。上述结果提示自噬信号通路参与了OLA对PA诱导的脂毒性的保护作用。

图4 抑制自噬抑制了OLA对PA诱导脂毒性的保护作用［注：A：Western blot测定LC3B Ⅰ/Ⅱ的蛋白表达；B：上清LDH含量检测；C：Hoechst染色观察（400×）］

2.5 OLA通过激活AMPK磷酸化激活自噬 现有研究表明AMPK的激活参与自噬的正向调控。为验证AMPK是否参与OLA激活自噬对脂毒性的保护作用，分别以10、20和40μmol/L的OLA处理Aml-12肝细胞12h，通过Western blot检测细胞内AMPK磷酸化水平，结果表明OLA以剂量依赖关系激活AMPK的磷酸化（P＜0.05，图5A）。分别使用AMPK化学抑制剂（compound C，1μmol/L）或AMPK siRNA 对AMPK进行抑制，结果表明抑制AMPK可显著阻断OLA对脂毒性的缓解作用（P＜0.05，图5B、C）。

图5 OLA通过激活AMPK磷酸化缓解脂毒性（注：A：Western blot测定磷酸化AMPK、AMPK的蛋白表达；B&C：LDH含量检测）

3 讨论

本研究证实OLA对PA诱导的Aml-12细胞脂毒性具有保护作用，结果表明OLA通过激活自噬发挥其有益作用。进一步研究表明AMPK信号通路参与了OLA对脂毒性的保护作用。

NAFLD已成为严重威胁人类健康的疾病。近年来中医药在防治NAFLD 已经取得了较好的效果。NAFLD在历代典籍中已有记载，并根据临床表现总结出该病“胁痛”、“痞满”、“积聚”、“肝癖（痞）”等病因病机。何道同等［8］认为，肝脾功能失常是脂肪肝发病的始动因素［8］。有研究将NAFLD病因病机归纳为饮食失调、肝郁气滞、肝失疏泄［9］。NAFLD病机可简要概括为“痰瘀互阻、脂浊积聚、肝络不和”。而女贞子具有补气舒肝之功效，已有研究表明女贞子可显著改善高脂饮食诱导的NAFLD［7］，而OLA是女贞子的主要成分，研究显示OLA显著抑制高脂饮食诱导的肥胖［10］，也能够保护由果糖诱导的NAFLD［11］。但是其机制并不清楚，尤其是对脂毒性的改善作用不明确，本研究通过PA诱导肝细胞建立肝细胞脂毒性模型，使用OLA进行干预，结果显示OLA能够以剂量依赖关系改善PA诱导的Aml12肝细胞脂毒性的作用。

自噬是一种重要的分解代谢程序，用于处理各种大分子细胞内容，包括蛋白质聚集体、功能失调的亚细胞器，以维持细胞稳态。当非脂肪细胞脂质过度沉积，机体可通过脂肪代谢产物、氧化应激等途径激活自噬，以保护非脂肪组织免受脂毒性损害［12］，因此增强自噬是治疗非酒精性脂肪性肝病、代谢综合征等相关疾病的新途径，作者前期发现激活自噬可以保护脂毒性诱导的肝损伤［13］，在本研究中证实了这个结论。更重要的是作者发现了OLA可以激活自噬，检测了OLA对Aml12肝细胞自噬的调节作用。结果表明，OLA是自噬的强诱导剂，观察到OLA作用后导致自噬标志蛋白LC3B的表达显著增加，且抑制自噬可阻断OLA的保护作用，说明OLA通过激活自噬发挥脂毒性保护作用。

目前OLA如何激活自噬的分子机制尚不清楚，研究表明AMPK是自噬的上游调控分子，而Matumba等［14］研究表明OLA可显著激活AMPK，因此，推测OLA可激活AMPK并发挥脂毒性保护作用。本研究结果显示，OLA能过激活AMPK的磷酸化，但结果表明抑制AMPK并不能完全抑制OLA对脂毒性的保护作用，说明还有其他分子信号通路参与该保护作用，需要后续深入研究。