高效多环芳烃降解菌的筛选、鉴定及降解特性分析

张娟琴,陈思尹,,唐卫红，白娜玲,李双喜,郑宪清,肖 明,吕卫光*

(1 上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海市农业环境保护监测站，农业部上海农业环境与耕地保育科学观测实验站，上海低碳农业工程技术研究中心，上海 201403；2 上海师范大学，上海 200235；3 上海市农业技术推广服务中心，上海 201103)

多环芳烃(PAHs)由两个或两个以上的芳环稠合而成，根据芳香环数目和组合方式的差异分为：低分子量PAHs(2—3个芳香环)、高分子量PAHs(4个及以上芳香环)两类。PAHs具有诱变性、致癌性、生物累积性、不易降解等特点，先后被多国列入优先控制污染物[1-2]。PAHs主要来源化石燃料的燃烧、生活垃圾的焚烧以及化工行业排放的废弃物等，全世界每年约有43 000 t、230 000 t的PAHs分别排入大气环境、水体环境，造成严重的污染[3-5]。微生物生长周期短、种类丰富、易于驯化培养，使其修复具有便于操作、修复成本低、对生态环境影响小等特点，在PAHs污染修复与治理方面，具有良好研究及应用前景[6-7]。近几十年来，分离所得的各类降解PAHs的微生物中，细菌的数量居于首位[8]，主要类型包括伯克氏菌属[9]、分支杆菌属[10]、鞘氨醇单胞菌属[11]、假单胞菌属[12]、红球菌属[13]、芽胞杆菌属[8]等，但高分子量PAHs降解菌较少[5,14]。本试验对污染环境中分离所得的菌株进行筛选，分析其在PAHs液体培养基中的降解特性，以筛选高效的PAHs降解菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌

供试菌主要为上海金山石化厂附近的土壤中分离所得，分别编号sh0、sh1、sh2、sh3、sh4、sh5、sh6、t1、t5、B5，其中B5为上海师范大学提供,用于筛选高潜能的PAHs降解菌。

1.1.2 培养基

无机盐培养基：NaMoO4·2H2O 0.001 gL、MnSO4·H2O 0.005 gL、ZnSO4·7H2O 0.005 gL、MgSO4·7 H2O 0.2 gL、CaCl20.02 gL、FeCl3·6H2O 0.05 gL、K2HPO4·3H2O 1.3 gL、KH2PO41.0 gL、NH4NO31.0 gL、CuSO4·5H2O 0.000 5 gL，固体培养基再加入1.5%的琼脂粉。

选择性培养基：灭菌的无机盐培养基冷却至82 ℃时加入PAHs丙酮溶液摇匀，待丙酮完全挥发后备用。

1.2 方法

1.2.1 PAHs降解菌的筛选

1.2.2 降解菌降解潜能分析

菌悬液的制备及粗酶液提取：富集培养后，菌悬液5 000 rmin离心6 min收集细胞，用pH 7.5，0.1 molL的磷酸钾缓冲液洗涤细胞两次，然后重新悬浮于相同的缓冲液中制成所需浓度的菌悬液。菌悬液加入5 mm 的小玻璃珠，使菌液没过小玻璃珠 1.0—1.2 cm在漩涡混合器上振荡破碎 5 min后，在8 000 rmin离心机上离心20 min，上清液即为粗酶液。

脱氢酶活性测定：采用氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法测定，用分光光度计测OD485值，通过标准曲线换算为三苯基甲臜(TF)的含量[15]。

邻苯二酚2,3-双加氧酶(C23Oase)：采用邻苯二酚氧化比色法，粗酶液加适量邻苯二酚溶液，置30 ℃左右温育30 min，用分光光度计测OD375值[16-17]。

1.2.3 菌株鉴定

1.2.4 菌株降解特性

降解菌株生长曲线：用适量的0.85%生理盐水将筛选到的菌株稀释至600 nm处光吸收值(OD600)为0.1的菌悬液，吸取1 mL菌悬液接入100 mL 液体选择培养基中30 ℃、200 rmin下振荡培养，定时取样，每个平行3个重复，以OD600表示该菌株的生长量。

菌株对单一PAHs的降解：选择培养基萘、蒽、芘的终质量浓度分别为200 mgL、100 mgL、 50 mgL，每个试验组设置3个平行，每个平行设3个重复，30 ℃、200 rmin条件下避光振荡培养，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 取样，萃取样品中的 PAHs 后，采用高效液相色谱法测定，具体方法详见《中华人民共和国国家环境保护标准HJ478—2009》。

菌株对混合PAHs的降解：每个三角瓶100 mL，选择培养基萘、蒽、芘的质量浓度分别为200 mgL、100 mgL、50 mgL，每株菌设3个平行，每个平行设3个重复，并设一不加菌空白对照组，30 ℃、200 rmin条件下避光振荡培养，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 取样后，分析 PAHs 的含量，方法同上。

PAHs的降解率(Degradation rate，DR)：用以表示菌株对PAHs的降解效果，其计算公式为：

(1)

其中：C0为PAHs的初始质量浓度(mgL)，Cn为第n次采集样品后测得的PAHs质量浓度(mgL)。

2 结果与分析

2.1 PAHs降解菌的筛选

以PAHs的模式化合物萘为底物进行平板初筛，从供试菌株中筛选出5株生长较好，直径大于15 mm的菌株，其分别为t1、t5、sh2、sh4、B5(图1)。

2.2 降解菌降解潜能分析

生物体内的氧化还原反应绝大多数在脱氢酶及氧化酶的催化下进行，脱氢酶、双加氧酶活性间接反映菌株降解潜力[18]。选取在萘选择培养基中生长较好的菌株sh4、sh2、t1、t5、B5，测定其脱氢酶、双加氧酶活性，分析降解潜能，对降解菌进行复筛。菌株sh4、sh2、t1、t5、B5的脱氢酶活性[单位mg TF(L·h)]分别为49.93、35.64、11.97、15.30、41.61。菌株sh4、sh2、B5的脱氢酶活性显著高于t1、t5(图2)。菌株sh4、sh2、B5的双加氧酶活性较菌株t1、t5高出1倍以上。菌株B5的双加氧酶活性最高，较菌株sh4、sh2分别高出40.86%、87.28%(图3)。

2.3 菌株鉴定

16S通用引物PCR扩增得到目的DNA片段经测序后，分别得到长度为1 359 bp(sh2)、1 372 bp(sh4)DNA序列，基因序列上传至 NCBI 网站进行16S rDNA序列比对。根据比对结果，sh2属于中华单胞菌属(Sinomonas)，与Sinomonassp.R-NB-15(KM083584.1)序列相似性为100%；sh4属于罗尔斯通菌属(Ralstonia)，与Ralstoniapickettiistrain QL-140(KJ780055.1)序列相似性高达99%。B5为伯克氏菌(Burkholderia)(为上海师范大学肖明教授实验室提供的已知菌种)。

2.4 降解菌降解特性

2.4.1 降解菌株对单一PAHs的降解特性

为了探究不同环数的PAHs对降解菌降解特性的影响，采用复筛所得的菌株sh2、sh4、B5分别对二环萘(Nap)、三环蒽(Ant)、四环芘(Pyr)进行降解试验，定时取样测定菌株的生长量与相应的PAHs的降解率。

菌株sh2、sh4、B5均能在以萘为唯一碳源的无机培养基中生长，分别在36—48 h进入对数增长期，在72—84 h时细菌的生长量达到最大值。菌株B5的最大生长量较sh2、sh4，分别高出45.14%、35.76%(图4)。在细菌生长量达到最大时，sh2、sh4、B5三株菌萘的降解率达81%以上，菌株B5 萘的降解率分别比菌株sh2、sh4高18.19%、9.09%(图5)。

菌株sh2、sh4、B5在蒽培养基中培养的前48 h生长缓慢，在84—96 h细菌的生长进入平缓期，菌株B5的最大生长量比菌株sh2、sh4分别高出56.85%、37.04%(图6)，蒽的降解主要发生在48—96 h内，菌株sh2、sh4、B5对蒽的最大降解率分别为65.00%、76.12%、83.23%(图7)。

菌株B5、sh4在芘培养基中生长状况明显好于sh2，在36—48 h进入快速增长期，最大生长量分别较sh2高出51.50%、44.88%(图8)，芘的降解主要发生在48—96h内，菌株sh2、sh4、B5对芘的最大降解率分别为53.10%、68.23%、72.17%(图9)。

随着PAHs环数的增加，菌株B5、sh2生长速度及最大生长量均呈下降趋势。菌株B5、在萘、蒽、芘培养基中的最大生长量(OD600)分别为0.576、0.540、0.433，而sh2在萘、蒽、芘培养基中的最大生长量(OD600)更小，分别为0.316、0.233、0.210。而多环芳烃的环数对菌株sh4的生长影响不明显(图4、图6、图8)。同样随着PAHs环数的增加菌株的降解能力下降，B5、sh2、sh4三个菌株对蒽、芘降解率较萘分别下降了15.56%—19.75%、20.14%—32.56%，其中菌株B5对萘、蒽、芘的降解效果最好(图5、图7、图9)。

2.4.2 降解菌株对混合PAHs的降解

菌株sh4在混合PAHs中的生长趋势与单一PAHs介质中相似，而菌株B5、sh2优先以萘为碳源，与萘基质中的生长趋势相似，菌株的增长量随着混合多环芳烃碳源量的增加出现上升趋势，但差异不显著(图4、图6、图8、图10、图11、图12)。菌株B5、sh4、sh2对萘、蒽、芘的降解率分别为：82.17%—99.13%、70.76%—87.25%、52.59%—75.07%。萘的降解主要发生在72 h内，蒽、芘随着环数的增加降解率下降。菌株B5、sh4对芘降解率均达到70% 以上，而菌株sh2降解仅为52%(图10、图11、图12)。

3 讨论与结论

PAHs微生物降解一直是国内外研究的热点，而微生物具有生长周期短、易于驯化培养、种类丰富等优点，在PAHs的生物修复、转化及清除中具有良好的应用前景，因此筛选高效降解菌是最为关键的环节[5]。本试验通过萘选择平板法从10株菌株中初筛出5个菌株，然后通过脱氢酶活性、双加氧酶活性分析降解菌的降解潜能，复筛得到菌株B5、sh4、sh2，通过16S rDNA序列比对分析：sh2为中华单胞菌(Sinomonas);sh4为罗尔斯通菌(Ralstonia);B5为已知菌种伯克氏菌(Burkholderia)。

本试验中筛选的伯克氏菌B5、罗尔斯通菌sh4、中华单胞菌sh2均以单一多环芳烃 萘、蒽、芘为唯一的碳源，随着多环芳烃环数的增加，降解率下降，120 h内萘、蒽、芘的降解率分别为81%—99%、65%—83%、53%—72%。黄兴如等[14]报道根瘤菌SL-1对单一多环芳烃菲(100 mgL)、芘(50 mgL)5d的降解率分别为100%、74%。毛健等[19]筛选的副球菌7d内对50 mgL芘的降解率为47.2%。相较而言，菌株B5、sh4、sh2对单一多环芳烃 萘、蒽、芘均具有较高的降解能力，而菌株B5、sh4对单一PAHs的降解能力明显高于sh2，这可能与菌株B5、sh4具有较高的脱氢酶、双加氧酶活性有关。陈思尹[16]研究发现，萘等低分子量PAHs的降解是在氧化还原酶的参与下完成。有研究表明，细菌的双加氧酶可同时将两个氧原子催化结合到PAHs的分子结构中，氧与苯环结合生成C-O键，再经加氢、脱水，使苯环的 C-C 键断裂，从而达到降解作用[20]。除了与微生物降解有关的酶活性，细菌的生长活性也可表征PAHs的降解效果[21]。本试验在监测PAHs的浓度的同时，以降解菌生长活性作为参考指标，结果也表明PAHs降解率随着细菌生长量的增加而增加，PAHs降解趋势与细菌增殖速度、最大生长量相关。

环境中PAHs污染物均以混合形式存在，因此研究降解菌对混合PAHs的降解效果具有现实意义。试验结果表明B5、sh4、sh2均具有较高的降解能力，尤其是B5、sh4。研究发现菌株B5、sh2优先以萘为碳源，混合多环芳烃中萘主要发生在72h内，降解率为82%—99%，而蒽、芘的降解速率随着多环芳烃环数的增加而下降，说明菌株B5、sh2优先以低环PAHs为碳源。黄兴如等[14]研究假单胞菌降解对混合PAHs萘、菲、芴、芘的降解特性，得出了相同的结论。菌株sh4对混合PAHs中萘、蒽、芘120 h的降解率分别为93.31%、79.14%、70.41%，与单一PAHs萘(90.27%)、蒽(76.12%)、芘(68.23%)降解率相比，降解趋势相似，降解率略有上升。同时菌株sh4与单一PAHs中萘、蒽、芘的生长量及趋势差异较小，说明菌株sh4受PAHs环数的影响较小，具有降解高环PAHs的潜能。混合PAHs体系中随着碳源量的增加，3个菌株的增殖量、PAHs的降解率均略有上升，但差异不显著，这可能与PAHs的水溶解性相关。王春明[21]研究了纤维微细菌、微杆菌等对PAHs的降解特性，结果表明多环芳烃降解与其溶解性相关。

综上所述，菌株B5、sh4、sh2对萘、蒽、芘均具有较好的降解效果。相同条件下，菌株的降解效果与其双加氧酶、脱氢酶活性正相关，因此菌株B5对PAHs的降解效果最佳。菌株sh4的增殖受PAHs环数的影响较小，具有降解高环PAHs的潜能。