液相色谱串联质谱法测定人尿液中头孢噻肟和他唑巴坦含量及在中国健康志愿者中的尿药排泄特征研究

陈 柠，孙鲁宁，胡文卉，王逸雅，王永庆*，丁 黎，*

1 中国药科大学 药物分析教研室,南京 210009；2 南京医科大学第一附属医院 临床药理研究室,南京 210029；3 南京科利泰医药科技有限公司,南京210009

头孢噻肟（CTX）为广谱的第三代头孢类抗菌药，其疗效在临床的广泛应用中逐渐受到了耐药菌的严重威胁[1]。他唑巴坦（TAZ）是一种β-内酰胺酶抑制剂，能够对大部分耐药菌产生的广谱β-内酰胺酶（ESBLs）发挥抗菌作用[2]。注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠（CTX-TAZ）（6∶1），具有明显协同抗菌效果，对产酶细菌和非产酶细菌的抑制活性高于单用头孢噻肟或其他比例联用的头孢噻肟钠他唑巴坦钠[3]。CTX-TAZ 的主要适应症之一是尿路感染，因此有必要对其尿药排泄特征进行研究。鉴于目前未见有关CTX 和TAZ 人体尿药浓度同时检测的方法以及中国健康人静脉注射CTX-TAZ（6∶1）后的尿药排泄特征的报道，本研究建立了一种快速的LC-MS/MS 方法同时测定尿液中CTX 和TAZ 的含量，应用于尿排特征的研究。此法与同时测定血浆中CTX 和TAZ浓度的HPLC-MS（液质串联色谱）法[3]相比，和单独测定TAZ 的方法[4]比较，具有快速、灵敏的优点。

1 材 料

1.1 仪器

LC-30AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Triple QuadTM 5500 质谱仪（Applied Biosystems/Sciex 公司），CPA225D 电子天平（Sartorius 公司）等。

1.2 药品和试剂

注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠（6∶1）（含头孢噻肟钠1.0 g、他唑巴坦钠0.17 g，批号：20160901，南京优科制药有限公司）；头孢噻肟钠对照品（Aladdin，纯度：99.52%，批号：K1512055）、他唑巴坦钠对照品（TRC，纯度：97%，批号：6-ABY-142-1）、他唑巴坦钠-13C2，15N1（内标，纯度：96.0%，同位素纯度：97.9%，批号：5-YSS-19-2）均为加拿大TRC 公司产品。

甲醇、乙腈、异丙醇（色谱纯，Merck KGaA 公司）；醋酸铵、乙酸（分析纯，Sigma-Aldrich 公司）；超纯水（Milli-Q 制备）。

2 方 法

2.1 尿液中CTX 和TAZ 的LC-MS/MS 测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate XB-C18（50 mm× 2.1 mm，3 μm，Welch）；柱 温：35 ℃；流 动 相A（MPA）：含0.05%乙酸和5.0 mmol 醋酸铵的水溶液，流动相B（MPB）：100%甲醇（对于CTX，MPA∶MPB=60∶40；对于TAZ，MPA∶MPB=85∶15）；流速：0.3 mL·min-1；进样量：5.0 μL；自动进样器温度：8 ℃。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾离子化（ESI），负离子模式，多反应监测（MRM）。裂解电压为-4 500 V，气帘气压力为207 kPa，雾化气压力为207 kPa，辅助气压力为345 kPa，干燥气温度为550 ℃。电参数设置见表1。

表1 待测物和内标的电参数

2.1.3 尿样处理方法 向96 孔板中加入50.0 μL尿液样品和30.0 μL 内标工作溶液（70.0 μg·mL-1）；涡旋1 min，向所有样品孔中加入400 μL 乙腈；将密封的96 孔板充分振摇10 min，离心（25 ℃，4000 r·min-1，10 min）；取30.0 μL 上清液用超纯水稀释10倍，充分振摇，用含5.0%乙腈和2.0%异丙醇的水溶液再次稀释10 倍，充分振摇混匀后进样分析。

2.2 临床试验方案

本研究经南京医科大学附属第一医院伦理委员会批准（2017-MD-014.A2）和受试者的知情同意。10 名中国健康志愿者（6 名男性、4 名女性），年龄为18～45 岁，体重为（56.8±5.44）kg，BMI（身体质量指数）为（20.8±1.58）kg·m-2，病史，体格检查和实验室检查均未发现异常，试验期间统一饮食。

10 名健康志愿者采用静脉输注的给药方法，单次给予头孢噻肟钠他唑巴坦钠（6∶1）注射液2.34 g，输液体积为100 mL，输注时间为1 h。于给药前留取空白尿液，给药后的尿样于试验开始后0～2 h、2～5 h、5～8 h、8～12 h、12～16 h 内留取，于4 ℃储存，待上述时间段尿液收集结束，混匀并记录体积，再分别取出1.0 mL 于3 支标记好的试管中，于-75 ℃（±10 ℃）冰箱保存待测。

2.3 药动学参数计算方法

在未知尿液样品中，CTX 和TAZ 的浓度通过未知样品的峰面积比代入标准曲线，由Analyst 1.6.3软件计算得到。单次给药后，以CTX 和TAZ 在尿液中的浓度计算药物经肾排泄的速率和总量，评价给药后健康志愿者体内的肾排泄情况。使用Microsoft Excel 2013 软件计算受试者单次给药后CTX 和TAZ 的累积排泄量、累积排泄率。各时间段的尿药浓度测定值与相应时间段尿液总体积相乘，得到各时间段药物排泄量，其与相应时间段时间长度之比为各时间段药物排泄速率；各时间段药物排泄量之和为药物累积排泄量，其与给药剂量相比即得相应时间内的药物累积排泄百分率[5]。

3 结果

3.1 LC-MS/MS 测定方法的评价

3.1.1 方法专属性 在“2.1.1”和“2.1.2”项下的色谱和质谱条件下，CTX、TAZ 和内标峰形良好，内源性物质不干扰测定。CTX、TAZ 和内标的保留时间分别为2.87 min、1.02 min 和1.02 min。见图1。

3.1.2 尿液中CTX 和TAZ 标准曲线制备及定量下限 分别配制浓度为4.00、8.00、40.0、200、1 000、2 500、4 000、5 000 μg·mL-1的CTX 标准含药尿样，浓度分别为0.300、0.600、3.00、20.0、100、250、400、500 μg·mL-1的TAZ 标准含药尿样，按“2.1.3”项下方法进行前处理。以峰面积（As）与内标峰面积（Ai）的比值f（f=As/Ai）对尿药浓度C 作权重回归计算，权重系数w=1/C2，得典型回归方程：对于CTX，f=3.45×10-3C+3.43×10-3（r=0.998 3）；对于TAZ，f=4.40×10-2C+1.47×10-3（r=0.999 7）。结果显示，CTX 浓度在4.00～5 000 μg·mL-1范围内线性关系良好，最低定量限为4.00 μg·mL-1；TAZ 浓度在0.300～500 μg·mL-1范围内线性关系良好，最低定量限为0.300 μg·mL-1。

3.1.3 精密度、回收率和基质效应 分别配制两种药物的系列标准含药尿样，包括定量下限浓度（LLOQ QC）、低浓度（LQC）、中浓度（MQC）、高浓度（HQC）；即CTX 浓度为4.00、10.0、300、3750μg·mL-1，以及TAZ 浓度为0.300、0.800、10.0、375 μg·mL-1的标准含药尿样，进行精密度、回收率和基质效应考察，得到CTX 和TAZ 的批内精密度分别为RSD＜8.7%、RSD＜7.7%；批间精密度分别为RSD＜6.5%、RSD ＜8.8%；批内准确度范围分别为100.9%～109.0%、97.1%～108.5%。

将6 个重复的LQC、MQC、HQC 样品与18 个双空白样品按“2.1.3”项下方法进行前处理。在处理后双空白样品中，加入含有CTX、TAZ 和内标的溶液，使三者进样浓度与质控样品的进样浓度一致，同时进样。将LQC、MQC、HQC 样品的峰面积设为A，前处理后加入相应浓度CTX、TAZ 及内标的双空白样品的峰面积设为B，分别计算CTX、TAZ 和内标的提取回收率=A/B×100%。对于CTX 分别为91.3%（LQC）、91.8%（MQC）、92.9%（HQC），对于TAZ 分别为93.7%（LQC）、98.3%（MQC）、89.9%（HQC），对于内标为93.8%。

将6 个不同来源的双空白样品，按“2.1.3”项下方法进行前处理后加入含有CTX、TAZ 和内标的溶液，使其进样浓度与低、中、高质控样品的进样浓度一致。同时配制与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致的溶液，同时进样。将基质存在下的峰面积设为C，不含基质的相应浓度溶液的峰面积设为D，分别计算CTX、TAZ 和内标的基质因子=C/D×100%。CTX、TAZ 的基质因子除以内标的基质因子，得到内标归一化基质因子分别为97.5%（LQC）、96.5%（MQC）、95.8%（HQC）。批间准确度范围为98.7～106.7%；内标归一化基质因子分别为102.5%（LQC）、101.2%（MQC）、96.7%（HQC）。

结果表明，尿液中CTX 和TAZ 精密度与回收率均良好，尿液基质对其离子化没有影响。

3.1.4 稳定性考察 配制CTX 和TAZ 低、高两个浓度的标准含药尿样，室温放置16.5 h，在-20 ℃/-70 ℃条件下反复冻融5 次，-20 ℃条件下长期冰冻34天，-70 ℃条件下长期冰冻191 天，考察其稳定性。结果显示，在上述条件下，尿液中CTX 和TAZ 的稳定性均良好。处理后的待测溶液于8 ℃自动进样器中放置7 天22 小时稳定性良好。

3.2 人体尿药排泄特征

10 名健康受试者单次给予本品注射液2.34 g后，测得尿液中CTX 和TAZ 的平均排泄速率-时间曲线，见图2A；CTX 和TAZ 的平均累积排泄百分率-时间曲线，见图2B。结果表明，CTX 和TAZ 在尿液中的排泄速率达到峰值的时间均为1 h，最大排泄速率分别为（459±67.8）ng·h-1、（128±14.7）ng·h-1，累积排泄率分别为51.7%±6.2%、84.3%±8.1%，即本品中约一半的CTX 以原型药物的形式经肾排泄，TAZ 主要以原型药物的形式经肾排泄。本研究结果可作本品用于尿路感染的主要依据之一。

4 讨论

由于CTX 与TAZ 尿液浓度较高，若按照常规的工作溶液与空白尿液1∶19 配制标准含药尿样，则储备液浓度很高（对于CTX，超过100 mg·mL-1；对于TAZ，超过10.0 mg·mL-1），在此种情况下，CTX 和TAZ 可能存在溶解度问题，且将耗费大量的对照品。本试验采用空白人尿液直接稀释对照品、配制CTX 及TAZ 的储备液，且证明了两种对照品在尿液中的溶解性良好。对于储备液，配制完成后立即分装，分装的储备液按需取用，一旦使用则仅当天有效，避免多次冻融。在试验过程中，直接用空白人尿液稀释储备液得到标准曲线及质控样品。曾考虑用头孢噻肟-d3作为CTX 测定时的内标，但CTX 对头孢噻肟-d3的干扰较大，需要设定一个较高的内标溶液浓度值，此将消耗大量的内标对照品。故采用他唑巴坦-13C2、15N1作为CTX 及TAZ 的共同内标。经验证，待测物与内标之间的干扰符合接受标准。本试验采用Ultimate XB-C18（50 mm×2.1 mm，3 μm，Welch）色谱柱，设置两段不同有机相比例的洗脱程序，实现了CTX 及TAZ 的同时测定。本试验建立的LC-MS/MS 法经验证可以用于尿液中CTX 及TAZ的测定。

许羚等[6]评估了头孢噻肟钠钠他唑巴坦钠（3∶1）静脉滴注后的尿排特征，累积排泄率与本试验所得结果一致，说明了头孢噻肟钠他唑巴坦钠不同配比不影响两者在体内的肾排泄情况。CTX 单独给药后的累积排泄率也与本试验中CTX 的累积排泄率一致，这表明合用TAZ 对CTX 的排泄没有影响[7]。Wise R 等[8]报道，TAZ 单独使用时的平均累积排泄率为63.7%±7.9%。任立玲等[7]也报道了头孢噻肟钠他唑巴坦钠（6∶1）静脉滴注后TAZ 的平均累积排泄率为61.7%±11.5%，均明显低于本试验中TAZ 的累积排泄率。但这两项研究，前者数据来源仅为6 名健康男性，样本量较小，可能存在个体差异；后者采用静脉滴注，给药方式不同。因此，后续研究可以比较头孢噻肟钠他唑巴坦钠联合用药与头孢噻肟钠他唑巴坦钠单独用药时、对尿药排泄特征的影响。