野菊花GRF基因家族的鉴定和生物信息学分析

王秀玲，李晓怡，卢婷婷，李艳玲

(河南牧业经济学院，河南 郑州 450046)

野菊花又称野黄菊花、苦薏，是一类中草药。早在3000多年前，我国就已经开始种植野菊花并且将其制成药材使用，是我国传统的药食兼优的花卉[1]。野菊花的生长要求不高，主要分布于中北部地区，常见其生长于田边、山坡草地、路边等[2]。野菊花性凉，具有很好的清热去火效果[3]。野菊花还有很好的抗菌消炎、保肝明目、疏散风寒、抗氧化、抗衰老乃至抗肿瘤等作用[4-5]。野菊花中的药理成分主要为黄酮类化合物、挥发油类和萜类、棕榈酸、多糖、叶绿素等[6]。黄酮类化合物包括蒙花苷、木犀草素和葡萄糖苷[7]。蒙花苷具有很好的抗氧化抗衰老以及抑制血糖升高等作用[8-9]，而木犀草素能够抑制癌细胞的增殖分裂和扩散，达到抗肿瘤的作用[10]。挥发油和萜类还可以使血管舒张血压降低[11]。

GRF因子是存在于植物中的一种调控其生长发育的物质[12]。OsGRF1是GRF家族的第一个成员，之后便不断有其他物种的GRF成员被研究出来[13]。据报道，拟南芥和油菜中分别有9个GRF成员和34个GRF成员[14]，水稻和杨树中分别有12个和19个GRF成员[15]。GRF蛋白是植物在DNA结合过程中起特异性靶向作用的部分[16]。GRF因子能够使植物细胞不断增殖分裂达到器官增大的目的，调控其生长[17]。GRF因子大量存在于在植物的根尖、嫩绿的叶片和刚发芽的嫩芽中，它可以调控细胞体积大小、叶片生长，刺激叶绿体分裂或者延长细胞分裂周期，使叶绿体数量增加，延缓叶片衰老，参与氮信号传导和光合作用[18]。

本试验对野菊花GRF基因家族各个成员的蛋白质理化性质分析、基因结构分析、潜在磷酸化位点预测和拟南芥中GRF基因家族之间的进化关系分析等，旨在为进一步研究野菊花中GRF基因家族的功能与作用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料基因序列的获取

从拟南芥官网(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥的全基因组蛋白序列和拟南芥的9个GRF家族成员的蛋白序列，从野菊花官网(http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html)下载野菊花的全基因组蛋白序列。

1.2 野菊花GRF基因家族成员的鉴定

参照拟南芥官网中的9个GRF基因的ID号，用Fasta Extractor将拟南芥中的9个GRF基因蛋白序列提取出来；利用Blast软件，对比拟南芥的9个GRF基因的蛋白序列，从野菊花全基因组的蛋白质序列中筛选出拟南芥GRF基因家族在野菊花中的同源基因，得到15个野菊花的GRF家族成员，再运用Fasta Extractor工具将得到的同源基因蛋白序列提取出来。

1.3 野菊花GRF基因家族成员的基本特性及进化分析

1.3.1 野菊花GRF基因家族蛋白质理化性质分析

运用ProtParam在线分析工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析野菊花GRF家族蛋白质的各种理化性质，包括氨基酸数量、蛋白质分子质量、等电点等。

1.3.2 野菊花GRF基因家族的亚细胞定位

运用Plant-mPLoc分析工具(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)在线预测GRF蛋白家族成员的亚细胞定位。

1.3.3 野菊花GRF基因家族成员和拟南芥GRF家族成员的进化树构建

为了解野菊花GRF基因家族和拟南芥基因家族的进化关系，运用MUCLE在线分析网站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)对野菊花GRF基因家族成员进行多序列比对，采用IQ-TREE(http://www.iqtree.org/tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg#)在线构建野菊花GRF基因家族的进化树。

1.3.4 野菊花GRF基因家族的基因结构分析

将得到野菊花的15个GRF家族成员的基因序列处理之后，运用GSDS网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线分析野菊花GRF基因家族的基因结构，即内含子和外显子。

1.3.5 野菊花GRF基因家族的结构域和保守基序分析

利用Home-PMC-NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)网站在线分析野菊花GRF基因的保守结构域。运用MEME在线网址(http://meme-suite.org/tools/meme)分析GRF家族成员的保守基序，并设置20个基序。

1.3.6 野菊花GRF基因家族的潜在磷酸化位点预测

运用软件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/)在线分析野菊花GRF蛋白家族成员的潜在磷酸化位点，参数均采用系统默认值。

1.3.7 野菊花GRF基因家族的蛋白质二级结构分析

利用在线二级结构预测软件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)对野菊花GRF蛋白序列的二级结构进行分析，分析内容包括α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链等。

2 结果与分析

2.1 野菊花GRF基因家族的鉴定及蛋白质理化性质分析

对比拟南芥的9个GRF基因家族成员的蛋白序列，利用TBtools工具对野菊花GRF基因家族进行Blast比对筛选，得到15个野菊花GRF基因家族成员，并根据与GRF结构域匹配程度分别命名为ChrGRF1-ChrGRF15。利用Protparam工具在线分析这些基因家族成员的蛋白质理化性质，如氨基酸数量、蛋白质分子质量、等电点等(见表1)。分析发现，15个GRF基因家族蛋白质各成员的氨基酸数量均有所不同，大多数介于250-548个之间。其中氨基酸长度最长的是ChrGRF2蛋白，氨基酸个数为883个；而 ChrGRF10蛋白和ChrGRF15蛋白的氨基酸数量较少，氨基酸个数分别为139个和138个。对等电点的分析发现，野菊花GRF蛋白家族的等电点在6.78-9.48之间，差距不大，除了ChrGRF1蛋白的等电点为6.78外，另外14个野菊花GRF蛋白家族成员的等电点都在7以上，此现象表明这些GRF蛋白家族成员可能含有较多的碱性氨基酸。这些蛋白质分子质量在15.5kDa-100.4kDa不等。通过亚细胞定位发现，所有GRF蛋白家族成员均定位在细胞核。ChrGRF10蛋白和ChrGRF15蛋白除了定位在细胞核外，还分别定位在细胞膜、叶绿体、细胞质、线粒体上，说明这两个成员还会发挥其他不同作用。

表1 响应面分析因素水平表

2.2 野菊花GRF基因家族的基因结构分析和进化树构建

用GSDS2.0在线系统得到15个野菊花GRF基因家族的基因结构及9个拟南芥GRF基因家族的基因结构，运用MUSCLE和IQ-TREE在线得到野菊花和拟南芥GRF基因家族成员的进化关系，将得到的基因结构图和进化树图用软件进行拼接，如图1所示。分析发现，在野菊花GRF基因家族中，ChrGRF12、ChrGRF14、ChrGRF15这3个家族成员含有的蛋白质编码区最少，数量为2个，ChrGRF5-ChrGRF10这6个家族成员均含有3个蛋白质编码区，ChrGRF3、ChrGRF4、ChrGRF11、ChrGRF13这4个家族成员含有4个蛋白质编码区，ChrGRF1基因含有6个蛋白质编码区，而ChrGRF2基因的蛋白序列最长，数量为10个，结合进化树和蛋白质理化性质分析结果，这个成员与其它家族的进化关系相差较远，发挥的功能也会有较大差异。这些家族成员之间所含有的外显子数量均有所不同，但亲缘关系较近的成员之间差异不是很大。由进化树可知，ChrGRF3、ChrGRF15和拟南芥的AtGRF1、AtGRF2、AtGRF9这三个家族成员亲缘关系比较相近，基因结构也相差不大。ChrGRF1和ChrGRF2各自单独成簇，推测这两个成员发挥的功能可能与其它成员具有较大差异。

图1 GRF家族成员在野菊花和拟南芥中的进化分析和基因结构分析

2.3 野菊花GRF基因的保守结构域

通过Home-PMC-NCBI在线分析网站分析野菊花GRF基因家族保守结构域，然后用TBtools工具构建保守结构域图。据报道，GRF基因家族含有两个保守结构域，即WRC和QLQ结构域。结果表明，野菊花GRF基因家族成员均含有WRC结构域，说明WRC结构域是非常保守的，在家族进化过程中几乎没有太大变动，这印证了WRC结构域在植物生长发育中所发挥的功能。其中ChrGRF3、ChrGRF4、ChrGRF5、ChrGRF6、ChrGRF7、ChrGRF8、ChrGRF9、ChrGRF11、ChrGRF13、ChrGRF15这10个成员不仅含有WRC这个结构域，还含有QLQ结构域。而ChrGRF1、ChrGRF2、ChrGRF12、ChrGRF14这四个成员虽不含QLQ结构域，但含有WRC结构域和其他结构域，由此推测这几个家族成员蛋白质功能具有多样性。

2.4 野菊花GRF蛋白家族成员的磷酸化修饰位点预测

生物体通过磷酸化产生ATP为自身提供能量，所以磷酸化所发挥的作用对于生物体来说至关重要。运用软件NetPhos 3.1 Server在线分析预测野菊花的15个GRF蛋白家族成员的潜在磷酸化位点，由表1可知，野菊花GRF蛋白家族成员均含有潜在的丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化位点。磷酸化位点个数最多的为丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的个数较少，且两种氨基酸位点个数相差不大，其中ChrGRF2蛋白中丝氨酸的磷酸化位点最多，达到81个，其潜在磷酸化位点总数也是最多的一个，为137个；而ChrGRF15蛋白潜在磷酸化位点总数则最少，为26个。

2.5 野菊花GRF基因家族蛋白序列的二级结构分析

运用蛋白质二级结构预测软件SOPMA对野菊花GRF蛋白序列的α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链等进行在线分析，如图3所示，野菊花GRF蛋白家族的成员全部都包含α-螺旋、β-转角、无规则卷曲及延伸链等部分，但各部分所占比例明显不同。由表1可知，GRF蛋白的二级结构主要是由无规则卷曲组成，除了ChrGRF2蛋白的无规则卷曲比例为45.53%外，其余均在50%以上，其次分别为α-螺旋和延伸链，而β-转角所占比例最低，均在7%以下。

3 结论

野菊花是一种应用价值较高的植物，具有抗菌消炎、清热去火、抗肿瘤、抗衰老等一系列药理作用，其治疗效果也颇为显著。GRF是调控植物生长发育的关键因子。目前已经鉴定出许多植物的GRF基因家族的成员，包括拟南芥、水稻、番茄等，其中对于拟南芥GRF基因家族人员的研究最为透彻，关于GRF基因的功能也做出了许多研究。本试验通过对比拟南芥GRF基因家族蛋白序列,对野菊花GRF基因家族成员进行筛选，然后对野菊花GRF基因家族成员进行一系列理化性质、基因结构、保守基序和保守结构域分析及进化分析，为进一步研究野菊花GRF基因家族成员的作用及其功能提供必要的理论基础。

本研究利用TBtools中的Blast软件对比拟南芥GRF基因家族成员蛋白序列，鉴定出了15个野菊花GRF家族成员，对这15个成员进行蛋白质理化性质分析发现，ChrGRF2蛋白的氨基酸数量最多，达到883个。亚细胞定位显示它们在植物的生长发育中发挥调控作用。对拟南芥的9个GRF基因家族成员和野菊花的15个GRF家族成员进行进化树分析发现，ChrGRF1和ChrGRF2这两个成员与其它成员的亲缘关系相差都非常远，而且它们的蛋白序列和基因结构都比较长，其中ChrGRF2的蛋白序列和基因结构最长。同时，ChrGRF15和AtGRF9、ChrGRF3和AtGRF1、AtGRF2亲缘关系最为相近，其基因结构也较为相似，发挥的功能也相似。通过分析GRF蛋白的保守基序可以发现，Motif1和Motif2这两个基序比较保守，它们所含有的保守基序种类也与其他成员不同，这两个成员共同含有Motif9、Motif12、Motif18、Motif20四个基序。通过潜在磷酸化位点定位分析发现，这些家族成员中含有的磷酸化位点个数最多的是丝氨酸，苏氨酸和酪氨酸的个数相差不大，但都比丝氨酸个数要少。分析这些家族成员的蛋白质二级结构发现，二级结构主要由无规则卷曲组成，其次为α-螺旋和β-转角，其中ChrGRF1和ChrGRF2的氨基酸数量和蛋白质分子质量较大，α-螺旋数量也最多，β-转角、无规则卷曲及延伸链则没有较大变化，推测α-螺旋结构的数量可能与蛋白质分子质量存在一定的正比例关系。