超声波辅助酶法提取青鱼鱼皮胶原蛋白工艺

王正云，蒋慧亮

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300）

胶原蛋白是动物结缔组织中的主要成分，占哺乳动物体内蛋白质的25%～30%，在食品、医药、化妆品等领域已得到广泛应用[1]。近年来，鱼类产品的下脚料被大量丢弃，不利于环境保护并且会造成资源的浪费。

青鱼（black carp）又名黑鲩、螺蛳青，属鲤形目、鲤科的雅罗鱼亚科。主要分布于我国长江以南的平原地区，是长江中、下游和沿江湖泊里的重要渔业资源，2014 年全国养殖产量约为55.7 万吨，为我国淡水养殖的“四大家鱼”之一，青鱼鱼皮中含有丰富的胶原蛋白。

现有资料表明，酶法提取对胶原蛋白破坏性小，能更好、更完全地得到活性蛋白[2]。常用的酶有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，具有反应快、时间短、无污染等优点，同时超声波提取因污染小、节能、环保等优点，已在当今生产、生活和科研等诸多领域被广泛使用，在生物活性物质提取中具有良好的应用前景[3-4]。

目前国内外对青鱼鱼下脚料鱼皮研究很少，对超声波辅助提取青鱼鱼皮胶原蛋白工艺未见报道，本研究以青鱼鱼皮为原料，在超声波辅助作用下，研究胶原蛋白的酶法提取工艺条件，为胶原蛋白相关产品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青鱼：市购；胰蛋白酶（250 U/g）、L-羟脯氨酸：上海润成生物科技有限公司；对二甲基氨基苯甲醛、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、氯化钠：国药集团化学试剂有限公司，为国产分析纯。

1.2 主要仪器

754 紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；TDL-40B 台式低速大容量离心机：金坛市金南仪器制造有限公司；EL20K 酸度计：梅特勒-托利多仪器有限公司；SHNS-SY-1000 超声波提取器：北京中西远大科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 胶原蛋白提取工艺流程

青鱼鱼皮的制备→NaOH 脱杂蛋白和脱色→正己烷去脂→水洗→超声波辅助酶提取→灭酶→离心→胶原蛋白提取液[5]

1.3.2 胶原蛋白提取操作要点

1.3.2.1 青鱼鱼皮的制备

将活青鱼去头、去内脏，对剖成两片后将鱼皮与鱼肉分离。将分离得到的鱼皮去鳞、去鳍，清水冲洗干净，阴凉处自然晾干，然后用剪刀将干净的鱼皮剪成碎片（5 mm×5 mm），放入密封袋封口后于-20 ℃冻藏备用。

1.3.2.2 青鱼鱼皮预处理

在4 ℃冰箱贮存条件下，用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡鱼皮1 h 用来脱杂蛋白和脱色，用蒸馏水清洗后，在同样温度条件下再用2 倍体积的正己烷浸泡鱼皮6 h 以去除脂肪，取出清洗后备用。

1.3.2.3 青鱼鱼皮胶原蛋白的提取

取预处理好的青鱼鱼皮，加入料液比为1∶20（g/mL）的一定pH 值的磷酸盐缓冲溶液进行浸泡溶胀，溶胀12 h 进行匀浆，加入适量的胰蛋白酶溶液，放入一定功率的超声波中处理一定时间，然后放入恒温水浴锅在35 ℃进行酶解提取，最后在100 ℃条件下灭酶10 min，冷却后在4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，取上清液测定青鱼鱼皮胶原蛋白提取率[6-7]。

1.3.3 单因素试验设计

试验以胶原蛋白的提取率为目标参数，每组用量为5 g，以加酶量、超声波处理时间、超声波功率、酶解温度、pH 值、酶解时间6 个因素进行单因素试验。每个水平平行测定3 次取其平均值。

1.3.3.1 超声波功率对胶原蛋白提取率的影响

在超声波处理时间50 min、加酶量100 U/g、酶解温度35 ℃、pH 7.5、酶解时间6 h 的条件下提取胶原蛋白，设置超声波功率分别为 300、400、500、600、700、800 W，研究超声波功率对胶原蛋白提取效果的影响。

1.3.3.2 超声波处理时间对胶原蛋白提取率的影响

在超声波功率600 W、加酶量100 U/g、酶解温度35 ℃、pH 7.5、酶解时间6 h 的条件下提取胶原蛋白，设置超声波处理时间分别为 10、20、30、40、50、60 min，研究超声波处理时间对胶原蛋白提取效果的影响。

1.3.3.3 加酶量对胶原蛋白提取率的影响

在超声波功率600 W、超声波处理时间50 min、酶解温度35 ℃、pH 7.5、酶解时间6 h 的条件下提取胶原蛋白，设置加酶量分别为 40、60、80、100、120、140 U/g，研究加酶量对胶原蛋白提取效果的影响。

1.3.3.4 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

在超声波功率600 W、超声波处理时间50 min、加酶量100 U/g、pH=7.5、酶解时间6 h 的条件下提取胶原蛋白，设置酶解温度分别为 25、30、35、40、45、50 ℃，研究酶解温度对胶原蛋白提取效果的影响。

1.3.3.5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响

在超声波功率600 W、超声波处理时间50 min、加酶量100 U/g、酶解温度35 ℃、pH 7.5 的条件下提取胶原蛋白，设置酶解时间分别为 3、4、5、6、7、8 h，研究酶解时间对胶原蛋白提取效果的影响。

1.3.3.6 pH 值对胶原蛋白提取率的影响

在超声波功率600 W、超声波处理时间50 min、加酶量 100 U/g、pH 7.5、酶解温度 35 ℃、酶解时间 6 h 的条件下提取胶原蛋白，设置pH 值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，研究pH 值对胶原蛋白提取效果的影响。

1.3.4 正交试验设计

根据单因素试验结果选取加酶量、酶解温度、pH值、超声波处理时间4 个因素为考察因素，设计四因素三水平的正交试验。试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels table in orthogonal experiment

1.3.5 鱼皮胶原蛋白提取率的测定

羟脯氨酸为胶原蛋白特有氨基酸，通过测定提取液中羟脯氨酸的含量计算出鱼皮胶原蛋白提取率。羟脯氨酸的测定参考国标：GB/T9695.23-2008《肉与肉制品羟脯氨酸含量测定》[8]。羟脯氨酸得率公式如下。

式中：W 为样品中羟脯氨酸得率，%；C 为羟脯氨酸的标准液质量浓度，μg/mL；V 为提取液总体积，mL；f 为稀释倍数；m1为原料质量，g；n 为换算系数（取0.1）。

青鱼鱼皮蛋白质含量测定参考国标GB5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的第一法凯氏定氮法[9]。青鱼鱼皮胶原蛋白提取率计算公式如下。

式中：X 为鱼皮胶原蛋白提取率，%；w 为羟脯氨酸含量，g；11.1 为羟脯氨酸换算为蛋白质的系数；m2为鱼皮蛋白质含量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声波功率对胶原蛋白提取率的影响

超声波功率对胶原蛋白提取率的影响见图1。

图1 超声波功率对胶原蛋白提取率的影响Fig.1 Effects of ultrasonic power on collagen extraction yield

由图1 可知，当超声波功率为300 W～600 W 之间时，胶原蛋白提取率与超声波功率呈正相关，随着超声波功率的提高，大量溶剂渗透到细胞中，从而提高提取率。当超声波功率达到600 W 时胶原蛋白提取率达到最高值。此后，提取率随着超声波功率的上升反而降低。这可能是由于功率过大的超声波破坏了鱼皮胶原蛋白的分子结构，从而导致胶原蛋白提取率下降[10-11]，因此本试验条件下超声波功率为600 W 时最佳。

2.1.2 超声波处理时间对胶原蛋白提取率的影响

超声波处理时间对胶原蛋白提取率的影响见图2。

图2 超声波处理时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.2 Effects of supersonic extraction time on collagen extraction yield

由图2 可知，随着超声波处理时间的延长，提取率不断增大，当超过50 min 时，提取率几乎不变。表明基本溶出全部胶原蛋白，但超声波处理时间过长可能会造成体系温度过高而降低酶的活性或破坏胶原蛋白的结构[12-13]。因此，初步选择超声波提取时间为40 min～50 min。

2.1.3 加酶量对胶原蛋白提取率的影响

加酶量对胶原蛋白提取率的影响见图3。

图3 加酶量对胶原蛋白提取率的影响Fig.3 Effects of amount of enzyme on collagen extraction yield

如图3 所示，刚开始时胶原蛋白提取率随着酶的加入量增大而显著增大，几乎呈线性关系，当加酶量超过100 U/g 之后，提取率略有下降。这可能是鱼皮中胶原蛋白与酶结合已达到饱和，再增加酶用量时不再提高胶原蛋白提取率，甚至可能导致胶原蛋白降解而使提取率下降[14-15]。同时考虑到成本，酶用量选择在80 U/g～120 U/g 为宜。

2.1.4 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响

酶解温度对胶原蛋白提取率的影响见图4。

图4 酶解温度对胶原蛋白提取率的影响Fig.4 Effects of enzyme extraction temperature on collagen extraction yield

由图4 可知，酶解温度对胶原蛋白提取率具有双重影响[16-17]，刚开始时随着酶解温度的提高，胶原蛋白提取率不断上升，在35 ℃时达到最大值，但当酶解温度继续升高进行提取时，提取率直线下降，说明酶解温度为30 ℃～40 ℃为胰蛋白酶的最适温度范围，超过此温度酶活性会受到抑制，而降低胶原蛋白的提取率。

2.1.5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响

酶解时间对胶原蛋白提取率的影响见图5。

图5 酶解时间对胶原蛋白提取率的影响Fig.5 Effects of amount of enzyme extraction time on collagen extraction yield

由图5 可知，在酶解提取初期的4 h 内，胶原蛋白提取率较低，胶原蛋白还未充分溶于提取液中，随后随着酶解时间的延长，胶原蛋白提取率逐渐增加，当酶解时间达到6 h 时，胶原蛋白提取率达到最大值，此后提取率几乎不再增加，说明胶原蛋白已基本提取完全，因此酶解时间在6 h 时胶原蛋白的提取效果最佳。

2.1.6 pH 值对胶原蛋白提取率的影响

pH 值对胶原蛋白提取率的影响见图6。

由图6 可知，在pH 值为7～8 时胶原蛋白提取率为最佳，低于或高于此pH 值范围，胶原蛋白提取率均不理想，与胰蛋白酶活性酸度范围一致。

2.2 正交试验结果及方差分析

基于单因素的试验基础上进行四因素三水平的正交试验，正交试验结果见表2。

图6 pH 值对胶原蛋白提取率的影响Fig.6 Effects of pH on collagen extraction yield

表2 正交分析结果表Table 2 Results of orthogonal analysis

采用L9（34）正交试验确定青鱼鱼皮胶原蛋白的超声波辅助酶提取最佳工艺[18-20]，由表2 极差分析可以看出：加酶量（A）、pH 值（B）、酶解温度（C）、超声波处理时间（D）4 个因素对鱼皮胶原蛋白提取率影响的主次关系C＞D＞A＞B，即影响因素酶解温度＞超声波处理时间＞加酶量＞pH 值。最佳提取工艺为即A2B2C3D3，即加酶量100 U/g、pH 7.5、酶解温度40 ℃、超声波处理时间50 min，在最优条件下进行进行3 次平行验证试验，得胶原蛋白提取率为45.3%。

应用SPSS17.0 统计软件对正交分析结果进行方差分析，分析结果见表3。

表3 正交试验方差分析Table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

续表3 正交试验方差分析Continue table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

由表3 可知，在影响胶原蛋白提取率的4 个因素中，酶解温度对胶原蛋白提取率影响极显著，加酶量和超声波处理时间影响显著，pH 值影响不显著，与正交试验极差分析结果基本一致。

3 结论

通过对各因素进行极差和方差分析表明：酶解温度对胶原蛋白提取率为极显著，加酶量及超声波处理时间对胶原蛋白提取率高度显著，pH 值对胶原蛋白提取率影响不显著，各因素对胶原蛋白提取率影响大小依次为酶解温度＞超声波处理时间＞加酶量＞pH 值。通过正交试验优化得到超声波辅助酶提取青鱼鱼皮中胶原蛋白最优提取条件为加酶量100 U/g、pH 7.5、酶解温度40 ℃、超声波处理时间50 min。在此条件下胶原蛋白提取率为45.3%。