绿球藻多糖分离纯化及抗氧化活性研究

李旭东，孙彦峰，冯佳，吕俊平，刘琪，南芳茹，刘旭东，谢树莲

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

天然多糖具有良好的生物活性和功能，包括抗肿瘤、抗病毒、免疫作用和抗氧化作用等[1-3]，在医疗和保健方面所具有的重要潜在应用价值日益显现，具有广泛的前景。近年来，人们发现一些微藻中富含多糖，具有增强机体免疫、抗病毒、抗恶性肿瘤、抗炎症、抗类风湿性关节炎、降血压、降血脂、降血糖、健胃、防早衰、抗辐射等防病治病的辅助作用，如紫球藻、念珠藻、螺旋藻等[4-6]。加上微藻具有生长速度快、适应性强、在人工培养下能够大量繁殖、占地面积小、生产成本低等特性，因此，藻多糖具有较高的商品价值和广阔的市场前景[7]。

绿球藻（Chlorococcum sp.GD）属单细胞绿藻，富含多糖、蛋白质、黄酮类、酚类、β-胡萝卜素等，其藻多糖能有效清除自由基，具有良好的抗氧化性，可用作饲料和食品生产实践[8]。

多种提取方法被报道用于藻类多糖提取。热水浸提法由于提取过程简单、成本较低，是主要的提取方法。该方法可将大部分水溶性多糖提取，但得到的多糖提取液中还含有大量藻体、细胞碎片、蛋白质和其它胶状物质等，这些杂质使提取液黏度增大，影响后续的分离纯化工序，因此需要进一步分离提纯[9-10]。

本文采用热水浸提法对绿球藻（Chlorococcum sp.GD）中的多糖进行提取，并利用纤维素层析和凝胶层析进行分级纯化，进而通过试验考查绿球藻粗多糖及纯化后多糖的抗氧化性，以期为进一步研究绿球藻多糖活性提供试验基础，同时也为绿球藻多糖的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿球藻（Chlorococcum sp.GD）：采自山西省关帝山。藻种由山西大学藻类学实验室分离、保藏并培养。

葡萄糖、维生素 C（VC）、硫酸、氯仿、氢氧化钠、正丁醇、三氟乙酸、氯仿、磷酸钠、邻苯三酚、氯化钠和无水乙醇：上海生工生物工程有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）、2，2′-连氮-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、过硫酸钾和菲洛嗪：Sigma 公司；以上试剂均为分析纯。

葡聚糖凝胶（Sephadex G-150）：上海江莱生物科技有限公司；二乙胺基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纤维素：美国Whatman 公司；所用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet iS50）：赛默飞世尔科技有限公司；紫外可见分光光度（TU-1810DAPC）：北京普析通用仪器有限公司；电热恒温水浴锅（HH-2）：常州国华电器有限公司；高速冷冻离心（HC-2518R）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；冷冻干燥器（SCIENTZ-18ND）：宁波新芝冻干设备股份有限公司；全功能酶标仪（Synergy H1）：美国BioTek Instruments，Inc.；旋转蒸发仪（RF-02）：上海普渡生化科技有限公司。

1.3 绿球藻多糖的制备及纯化

1.3.1 绿球藻粗多糖（crude Chlorococcum polysaccharide，CCP）的制备

将一定量的绿球藻粉末与蒸馏水按质量比1 ∶25混合，在95 ℃热水提取2 h，经真空抽滤后收集滤液，残渣再次热水提取1 h，合并两次滤液并用旋转蒸发仪80 ℃下浓缩至原体积的1/3，按3 ∶1 体积比加入氯仿-正丁醇溶液（4/1，体积比），沉淀蛋白2 次[11]。然后将水相与氯仿相分开，得到粗多糖溶液。提取液经再次浓缩至原体积1/3 后，按体积比1 ∶3 加入85%乙醇溶液沉淀多糖，4 ℃过夜。离心后将沉淀冷冻干燥，得绿球藻粗多糖CCP。

1.3.2 绿球藻粗多糖的纯化

称取绿球藻粗多糖0.2 g，用最少量的蒸馏水溶解。上 DEAE-52 纤维素层析柱（50 cm×2.6 cm），先用蒸馏水洗至无糖检出，依次用0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 洗脱，洗脱速度为1 mL/min，分管收集，每管5 mL，收集液用硫酸-苯酚法测定A490nm值，以管号为横坐标，A490nm

值为纵坐标绘制洗脱曲线[12]，并收集各洗脱峰部分，浓缩、透析、冷冻干燥。

取上述洗脱峰部分最多的多糖2 mg，溶于1 mL蒸馏水，上 Sephadex G-150 层析柱（100 cm×1.5 cm），用蒸馏水以0.2 mL/min 速度洗脱，按每管5 mL 接洗脱液，隔管用苯酚-硫酸法在波长490 nm 处检测吸光度，绘制洗脱曲线。

1.3.3 粗多糖含量的测定

准确称取标准葡萄糖20 mg 于500 mL 容量瓶中，加水至刻度，分别吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，各以蒸馏水补至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL 及浓硫酸5.0mL，摇匀冷却，沸水浴显色15min以后于490 nm 测吸光度，以2.0 mL 水按同样显色操作为空白，横坐标为糖含量，纵坐标为吸光值，绘制标准曲线[13]。

绿球藻粗多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品，建立了标准曲线。采用干重法，测定绿球藻粗多糖提取液中多糖含量。

多糖提取率/%=（测定液中多糖浓度×测定液总体积）/绿球藻多糖总质量×100

1.3.4 纯化多糖的紫外可见光谱扫描

收集纯化绿球藻多糖溶液，制成约1 mg/mL 溶液，用紫外-可见用紫外-可见分光光度计在紫外-可见区200 nm～500 nm 内进行扫描，得紫外-可见吸收光谱，观察其光谱特征及在波长260 nm 和280 nm 处紫外吸收特征，检测是否有核酸和蛋白质存在。

1.3.5 纯化多糖的傅立叶变换红外光谱扫描（fourier transform infrared spectrum，FTIR）

纯化多糖的红外光谱采用傅立叶变换红外光谱仪（Nicolet iS50）以衰减全反射模式进行扫描，扫描波数范围为 3 500 cm-1～650 cm-1，分辨率为 0.1 cm-1。

1.4 绿球藻多糖的抗氧化活性

1.4.1 对DPPH 自由基的清除作用

参照冯学珍等[14]的方法，略作修改。分别取500 μL不同质量浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的绿球藻多糖水溶液，加入500 μL 浓度为0.04 mg/mL 的DPPH溶液，混匀后室温25 ℃避光反应30 min，在波长517 nm处测定吸光度（A）值。对照组用500 μL 无水乙醇溶液代替DPPH 溶液，空白组用500 μL 去离子水代替多糖溶液，不同浓度的VC替代多糖样品作为阳性对照。每个样品重复3 次。

式中：A0为样品的吸光值；Aa为对照 （用500 μL无水乙醇溶液代替DPPH 溶液）吸光值；Ab为空白（用500 μL 去离子水代替多糖溶液）吸光值。

1.4.2 对羟基自由基的清除作用

参照程超等[15]的方法，略作修改。取1 mL 不同质量浓度的绿球藻多糖溶液 （0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）于试管中，向各管中加入2 mL 硫酸亚铁（FeSO4）溶液（3 mmol/L）和 1.5 mL 水杨酸溶液（1.8 mmol/L）。混匀后，加入0.03%双氧水0.1 mL 启动反应，混匀。37 ℃水浴30 min，在波长510 nm 下测定A 值。以去离子水代替多糖溶液做空白，不同浓度的VC替代多糖样品作为阳性对照。每个样品重复3 次。

式中：A0为空白（用去离子水代替多糖溶液）吸光值；Aa为样品的吸光值。

1.4.3 对超氧阴离子自由基的清除作用

参照陈玫等[16]和韩少华等[17]的方法，略作修改。向各管中加入900 μL 磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 8.2），25 ℃水浴 20 min，向各试管中加入 200 μL 不同质量浓度的多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。其中空白以去离子水代替多糖溶液，然后加入25 mmol/L的邻苯三酚溶液80 μL，混匀后于25 ℃水浴中反应5 min，加入 80 mmol/L HCl 200 μL 终止反应，并摇匀，反应3 min，5 000 r/min 离心。酶标仪波长420 nm 处测定吸光值。以去离子水代替多糖溶液作为空白，对照用磷酸盐缓冲液代替样品液。不同浓度的VC替代多糖样品作为阳性对照。每个样品重复3 次。

式中：A0为样品的吸光值；Aa为对照（磷酸盐缓冲液代替样品液）吸光值；Ab为空白（用去离子水代替多糖溶液）吸光值。

1.4.4 ABTS+自由基清除能力测定

参照有关文献的方法[18]，将ABTS 溶液（7 mmol/L，5 mL）和过硫酸钾溶液（140 mmol/L，88 μL）混合，室温25 ℃避光反应12 h～16 h，制备ABTS+自由基储备液。使用磷酸盐缓冲液（10 mmol/L，pH7.4）将储备液稀释至其在734 nm 处吸光值为0.70±0.02，备用。取不同浓度多糖溶液各1 mL，加3 mL ABTS+自由基溶液，于暗处反应1 h，记录其在734 nm 处的吸光度。以1 mL 纯水代替样品作为空白，相同操作。每个样品重复3 次。

式中：Ax为样品的吸光值；A0为空白的吸光值。

1.4.5 还原能力的测定

参照有关文献的方法[19]，准确量取1.0 mL 不同质量浓度的多糖样品（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。样品液移至10 mL 具塞试管中，加入1.0 mL 磷酸钠缓冲溶液（1.0 moL/L，pH 6.6）和 2.5 mL K3[Fe（CN）6]（1 %），50 ℃恒温水浴20 min，取出冷却后加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀，5 000 r/min 离心 5 min，取 2.5mL 上清液，加2.5 mL 蒸馏水和0.5 mL 1%FeCl3溶液，混匀。以蒸馏水为空白，于波长700 nm 处测定其吸光值，以VC作为对照[20]。每个样品重复3 次。

2 结果与分析

2.1 绿球藻多糖的特性

2.1.1 绿球藻粗多糖含量测定结果

绘制的标准曲线见图1，得到回归方程为Y =0.008 2X+0.090 6，相关系数R2=0.995 6。代入公式，计算出绿球藻粗多糖提取率为6.07%。

2.1.2 绿球藻粗多糖纯化分析

绿球藻粗多糖DEAE-52 纤维素柱层析洗脱曲线见图2。

图1 葡萄糖含量标准曲线Fig.1 Standard curve of of glucose content

图2 绿球藻粗多糖DEAE-52 纤维素柱层析洗脱曲线Fig.2 Elution curves of crude Chlorococcum sp.GD polysaccharides by DEAE-52cellulose column chromatography

由图2 可知，绿球藻粗多糖CCP 经DEAE-52 纤维素柱层析分离后获得3 个组分，分别命名为CPP-Ⅰ、CPP-Ⅱ和CPP-Ⅲ。将含量最高的组分CPP-Ⅰ进一步采用Sephadex G-150 凝胶层析柱纯化，得到组分CPP-Ⅳ，洗脱峰为单一峰（见图3），且峰形对称，表明CPP-Ⅳ为单一组分。

图3 绿球藻多糖CPP-ⅠSephadex G-150 柱层析洗脱曲线Fig.3 Elution curves of Chlorococcum sp.GD polysaccharides CPP-Ⅰby Sephadex G-150 column chromatography

2.1.3 绿球藻纯化多糖紫外光谱分析

绿球藻纯化多糖的紫外光谱见图4。

图4 绿球藻纯化多糖的紫外光谱Fig.4 Ultraviolet spectrum of polysaccharides from Chlorococcum sp.GD

由图4 可知，绿球藻纯化多糖在紫外区波长247 nm 处有最大吸收峰。由于核酸和蛋白质吸收峰为260 nm 和280 nm，而图中 260 nm 和 280 nm 处无吸收峰，表明绿球藻纯化多糖中核酸和蛋白质等杂质已清除，具有较高的纯度。

2.1.4 绿球藻纯化多糖红外光谱分析

绿球藻纯化多糖的红外光谱见图5。

图5 绿球藻纯化多糖的红外光谱图Fig.5 Infrared spectra of Chlorococcum sp.GD polysaccharides

从光谱特征看，CPP-Ⅳ在 3 180、2 984、1 629 cm-1及1 036 cm-1具有较强吸收，为典型的多糖特征吸收[21]。在波数 3 400 cm-1～3 180 cm-1的吸收峰主要为糖类的O-H 及 N-H 的伸缩振动，2 984 cm-1处的吸收峰为-CH3-键伸缩振动，2 943 cm-1处的吸收峰为-CH2-键伸缩振动，1 629 cm-1附近的吸收峰可能是酰胺基中C=O 伸缩振动，1 551 cm-1吸收峰为-NO2-伸缩振动，1 400 cm-1～1 200 cm-1内的吸收主要为C-H 变角振动引，1 295 cm-1可能是硫酸基吸收峰[22]，1 036 cm-1的强吸收是C-O-C 或C-O-H 中的C-O 键的弯曲振动，为葡萄糖的特征吸收[23-24]，909 cm-1处为C-H 变形振动，662 cm-1处为O-H 面外弯曲。由红外图谱可知CPP-Ⅳ具有明显的糖类化合物的特征。

2.2 绿球藻多糖的抗氧化活性分析

2.2.1 绿球藻多糖对DPPH 自由基的清除能力

图6 为绿球藻多糖对DPPH 自由基的清除能力。

图6 绿球藻多糖的DPPH 自由基清除率Fig.6 DPPH radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

由图6 可以看出，随着浓度的增加，绿球藻纯化多糖对DPPH 自由基的清除率逐渐增强。相比粗多糖，纯化多糖CPP-Ⅳ对DPPH 自由基的清除率明显更高。当粗多糖和CPP-Ⅳ的浓度达到0.6 mg/mL 时，DPPH自由基清除率基本稳定，超过90%。当CPP-Ⅳ的浓度达到1 mg/mL 时，DPPH 自由基清除率达到96.13%，与阳性对照VC基本相同。此前，有报道其他藻类多糖也具有较好的自由基清除能力，如紫球藻（Porphyridium cruentum）多糖在浓度为0.5 mg/mL 时清除率趋于稳定，达到84 %，娄翠等[25]海带（Laminaria japonica）岩藻多糖PFS-2 在浓度为1 mg/mL 时，清除率接近55%。相比之下，绿球藻多糖CPP-Ⅳ具有更好的DPPH 自由基清除能力。

2.2.2 绿球藻多糖对羟基自由基的清除能力

图7 为绿球藻多糖的羟基自由基清除率。

图7 绿球藻多糖的羟基自由基清除率Fig.7 Hydroxyl radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

由图7 可知，随着浓度的增加，绿球藻多糖对羟基自由基的清除率逐渐增强。纯化多糖CPP-Ⅳ对羟基自由基的清除率略高于粗多糖。当CPP-Ⅳ的浓度达到0.6 mg/mL 时，羟基自由基清除率基本稳定，超过70%。当CPP-Ⅳ的浓度为1 mg/mL 时，羟基自由基的清除率为70.6%，虽然效果不及VC（88.22%），但与有的藻类相比，效果明显更好。如地皮菜（Nostoc commune）多糖CCB 和CB-2-1 组分在1 mg/mL 时，羟基自由基清除率分别为35.2%和49.5%[26]。

2.2.3 绿球藻多糖对超氧阴离子的清除能力

图8 为绿球藻多糖的超氧阴离子清除率。

图8 绿球藻多糖的超氧阴离子清除率Fig.8 Superoxide anion radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

从图8 可以看出，随着浓度的增加，绿球藻多糖对超氧阴离子的清除率逐渐增强。粗多糖与纯化多糖CPP-Ⅳ对超氧阴离子的清除率基本相同。当CPP-Ⅳ和粗多糖的浓度达到1 mg/mL 时，超氧阴离子清除率分别达到52.46%和43.72%。虽然明显不及VC（96.13%）的清除能力，但仍然表明绿球藻多糖具有一定的抗氧化作用。

2.2.4 ABTS+自由基清除能力

绿球藻多糖的ABTS+自由基清除率见图9。

图9 绿球藻多糖的ABTS自由基清除率Fig.9 ABTS free radical removal rate of Chlorococcum sp.GD polysaccharide

从图9 可以看出，随着浓度的增加，绿球藻多糖对ABTS+自由基的清除率逐渐增强。纯化多糖CPP-Ⅳ效果略优于粗多糖。当CPP-Ⅳ的浓度达到1 mg/mL 时，ABTS+自由基清除率可达27.07%。虽然明显不及VC（约90%）的清除能力，但仍然表明绿球藻多糖具有一定的抗氧化作用。也有文献报道，泡叶藻（Ascophyllum nodosum）和铜藻（Sargassum horneri）多糖相同浓度下，ABTS清除率分别可达约40%和90%[27-28]。

2.2.5 还原力测定

绿球藻多糖的还原力见图10。

图10绿球藻多糖的还原力Fig.10 Reducing power of Chlorococcum sp.GD polysaccharid

从图10可以看出，随着浓度的增加，绿球藻多糖的还原力逐渐增强。纯化多糖CPP-Ⅳ效果优于粗多糖。当CPP-Ⅳ的浓度达到1 mg/mL时，OD700nm为0.404，虽然明显不及VC（1.223）的还原力（吸光度越大表示还原能力越强），但仍然表明绿球藻多糖具有一定的抗氧化作用。据有关文献[28-32]，在相同多糖浓度下，铜藻多糖（tongzao polysaccharide，TZP）组分OD700nm为0.8，月见草叶中提取的多糖OD700nm为0.6，枸杞多糖组分LBP2的OD700nm为0.521，米酒多糖OD700nm为0.494，紫薯多糖OD700nm为0.49。相比其他植物源多糖，绿球藻多糖也具有一定的还原力。

3 结论

采用传统热水浸提方法对绿球藻粗多糖进行分离纯化，多糖提取率为6.07%。通过DEAE-52纤维素柱层析和Scphadex G-150葡聚糖凝胶柱将绿球藻粗多糖组分进行分级纯化，得到4个组分CPP-Ⅰ、CPP-Ⅱ、CPP-Ⅲ和CPP-Ⅳ，且纯度较高。绿球藻多糖对DPPH自由基和羟基自由基具有明显的清除效果，清除率分别超过90%和70%，且纯化多糖CPP-Ⅳ的效果优于粗多糖CCP。绿球藻多糖对超氧阴离子和羟基自由基也具有一定的清除效果，虽然不及VC，但仍然表明纯化多糖具有很好的抗氧化活性，并且清除率随多糖的浓度增大而增加。