灵芝多糖的复合酶法提取工艺优化

丁霄霄，李凤伟，商曰玲，王笃军，王杰，卜雯丽，余晓红，*

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.盐城工学院海洋与生物工程学院，江苏盐城224051）

灵芝（Ganoderma Lucidum），又名赤芝、红芝、丹芝、瑞草等，是担子菌纲、多孔菌科、灵芝属（Ganoderma）真菌，常用其子实体，是一种药用真菌[1]。灵芝在我国有上千年的药用历史，富含灵芝多糖、三萜、甾醇、蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿质元素等多种生物活性物质和营养物质。其中，灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基、刺激胰岛素分泌以促进葡萄糖在外周组织的利用来降低血糖[2]、抗疲劳、促进核酸和蛋白质的合成[3]等多种药理活性，可通过清除自由基、抑制脂质过氧化损伤和增强抗氧化酶的活性对机体起到保护作用；另外，体内自由基过多是诱发炎症、衰老以及肿瘤等疾病的主要因素，因此多糖在抑制肿瘤、免疫调节[4]和消炎[5]等方面也有极其重要的作用；而近些年来有关灵芝多糖对肠道微生物的影响的报道逐渐增多[6]。灵芝子实体主要由纤维素、半纤维素和木质素3 种成分构成，三者可形成木素结合层，纤维素自身也可形成束状结晶区域，致使灵芝子实体具有较好的维持力和紧密的结构，而灵芝子实体多糖存在于子实体紧密的细胞壁内，导致灵芝多糖不容易被提取出来[7-8]。采用酶法提取灵芝多糖，条件温和，能使几丁质、半纤维素等与灵芝多糖分离，不会破坏多糖的结构有利于获得生物活性多糖，从而提高多糖的提取率，同时可以大规模用于工业化生产[9-10]。但与其他传统方法相比，采用复合酶法提取灵芝多糖的研究起步相对较晚，研究报道相对较少，为此，本研究在正交试验确定复合酶比例的基础上，利用响应面法对复合酶法提取灵芝多糖的提取条件进行了优化，以期获得较高的多糖提取率的提取工艺，为灵芝多糖的深入研究和进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝子实体：江苏德芝林生态农业有限责任公司。

纤维素酶（20 000 U/g）：郑州万博化工产品有限公司；半纤维素酶（20 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（＞2 000 U/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾：上海化学试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）、苯酚（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）、硫酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV752N 紫外可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；PB-20 型pH 计：德国赛多利斯公司；FA1104电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DNP 电热恒温培养箱：上海金宏实验设备有限公司；SHZ-D循环水真空泵、RE52CS 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HH-6 型数显恒温水浴锅、SK-1 型快速混匀器：江苏省金坛市瑞尔电器有限公司；85-2 型恒温磁力搅拌器：金坛市城东新瑞仪器厂；FD-1A-50 型冷冻干燥机：北京博医康有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复合酶法提取灵芝多糖

灵芝子实体预处理：洗净后干燥至恒重，粉碎，过20 目筛，用石油醚80 ℃于循环装置中水浴热处理2 d～3 d，除去脂类；干燥至恒重，密封保存待用。

称取灵芝子实体样品1.00 g 置于100 mL 烧杯中，各分别称取一定质量分数的纤维素酶、木瓜蛋白酶和半纤维素酶（相对底物浓度）[11]加入pH 值为5.70 的磷酸盐缓冲溶液配置成酶解液，按照1 ∶30（g/mL）的料液比加入酶解液，于40 ℃恒温水浴中酶解100 min。酶解结束后90 ℃热水中灭酶10 min，趁热减压抽滤后，将所得滤液浓缩至原体积的1/5，缓缓加入4 倍体积的无水乙醇，4 ℃下醇沉过夜。离心取沉淀，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤之后，用蒸馏水溶解，定容至100 mL 容量瓶，测定糖含量，计算多糖提取率。

1.3.2 糖含量的测定

采用苯酚硫酸法，以葡萄糖为对照品，参照文献[12]并加以改进制作标准曲线。以葡萄糖含量c 为横坐标（μg），吸光度A 为纵坐标绘制标准曲线，得线性方程A=0.006 7c+0.000 5，相关系数R2=0.999 2。取1 mL多糖溶液，同法显色后测吸光度A，代入方程即可进一步计算出灵芝多糖提取率。

1.3.3 复合酶法提取灵芝多糖工艺条件确定

1.3.3.1 各单酶最佳添加量确定

分别以纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶的添加量为自变量，保持酶解条件不变，按照1.3.1 的试验步骤进行试验，并分别记录相应吸光度，计算出灵芝多糖提取率，进而分析各单酶添加量对其影响，得各最佳添加量。

1.3.3.2 复合酶配比确定

根据上述1.3.3.1 试验结果，按照表1 进行三因素三水平正交试验，以复合酶配比为自变量，保持酶解条件不变，按照1.3.1 的试验步骤进行试验，以灵芝多糖提取率为指标，分析确定最佳复合酶配比。

表1 复合酶法提取灵芝多糖的正交试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design for extraction of Ganoderma lucidum polysaccharide by complex enzymatic method

1.3.3.3 响应面法优化复合酶法提取条件的确定

分别以其中一个提取条件的因素水平为自变量，保持上述所得最佳酶配比以及其他条件不变，按照1.3.1 步骤进行试验并记录相关数据。如研究不同酶解时间对灵芝多糖提取率影响时，仅改变时间40、60、80、100、120 min，保持酶配比、酶解温度和 pH 值不变；研究不同温度对提取率影响时，仅改变温度35、40、45、50、55 ℃时，保持酶配比、时间和 pH 值不变；研究不同pH 值对提取率影响时，仅改变pH 值4.30、4.65、5.00、5.35、5.70、6.05，保持酶配比、酶解温度和时间不变。

通过提取条件的单因素试验结果，分别得各最佳水平；在此基础之上，以酶解时间（A）、酶解温度（B）、酶解pH 值（C）为自变量，依据Box-Behnken 试验设计的原理，以灵芝多糖的提取率为响应值，按照表2 三因素三水平的试验设计[13-14]及1.3.1 的试验方法进行对提取灵芝多糖条件的优化。

表2 三因素三水平的Box-Behnken 试验设计Table 2 Three-level three-factors of experimental Box-Behnken Design

1.4 数据处理

按照表1 和表2 的试验设计进行试验，计算得到一系列的灵芝多糖提取率数据，分别采用软件正交试验设计助手和Design-Expert version 8.0 软件对其做进行进一步处理分析后，分别得出最佳酶配比和提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 复合酶添加量配比优化

2.1.1 各单酶添加量对灵芝多糖提取效果的影响

纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶添加量对灵芝多糖提取效果的影响见图1。

由图1 可知，不同种类以及不同添加量的酶对灵芝多糖提取率有明显的影响，原因在于灵芝子实体主要由纤维素、半纤维素和木质素3 种成分构成的木素结合层，子实体多糖存在于紧密的细胞壁内，而不同种类及添加量的酶能使几丁质、半纤维素等与灵芝多糖分离，有利于多糖的溶出，增加了多糖在溶剂中的溶解度。其中纤维素酶添加量达到3.0%时的多糖含量最高，提取率达到了2.94%，当添加量大于3.0%时提取率反而降低；而半纤维素酶添加量在1.0%～4.5%的范围内，多糖得率随着添加量的升高而增加，此后继续增加后多糖得率得变化趋势较平缓，最高提取率为2.34%；木瓜蛋白酶在添加量为2.5%时提取率达到最高1.66%，之后添加量大于2.5%时得率反而降低。因此3 种酶的最佳添加量为纤维素酶添加量3.0%，半纤维素酶添加量4.0%，木瓜蛋白酶添加量2.5%。

2.1.2 复合酶添加量配比的正交试验结果

复合酶添加量配比对灵芝多糖提取效果的影响见表3、表4。

表3 酶配比L9（34）正交试验结果Table 3 Enzyme ratio L9（34）orthogonal experimental results

由表3 极差分析结果可知，极差RA（0.52）＞RC（0.13）＞RB（0.10），因此改变纤维素酶添加量对灵芝多糖提取率影响最大。以K 值最佳选择最优方案为A3B2C3，即提取灵芝粗多糖的最佳复合酶的比例为：纤维素酶3.5%、半纤维素酶4.0%、木瓜蛋白酶3.0%，在此最佳复合酶比例下进行验证试验，测得灵芝多糖提取率为3.32%，达到最高；而由表4 方差分析表可知，与另外两种酶相比，纤维素酶添加量对灵芝多糖提取率的影响最为显著，其他两个因素对提取率的影响均不显著。

表4 正交试验结果方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.2 响应面优化复合酶法提取条件

2.2.1 提取条件单因素试验结果

2.2.1.1 酶解时间对灵芝多糖提取率的影响

按照正交试验结果选用最佳复合酶的比例，参照张天笑等[15]的试验并加以改进，保持酶解温度40 ℃、pH 5.70 不变，改变酶解时间，按照1.3.1 的方法进行试验，分析结果得出时间对灵芝多糖提取效果的影响见图2。

图2 酶解时间对灵芝多糖提取率的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

图2 表明，随着酶解时间的延长，多糖提取率在酶解时间为80 min 时灵芝多糖提取率达到最大提取率3.55%，此后呈下降的趋势。原因可能是由于用于酶解时间过长导致灵芝多糖结构发生变化，致使提取率降低。因此选择80 min 为试验最佳酶解时间。

2.2.1.2 酶解温度对灵芝多糖提取率的影响

按照上述的试验结果选用最佳复合酶的比例以及上述酶解时间单因素试验结果，参照翟为等[16]的试验并加以改进，保持酶解时间80 min、pH 5.70 不变，改变酶解温度，按照1.3.1 的方法进行试验，分析结果得温度对灵芝多糖提取效果的影响见图3。

图3 酶解温度对灵芝多糖提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

图3 表明，随着酶解温度的升高，灵芝粗多糖的提取率逐渐增大，当温度为50 ℃时，复合酶分解灵芝细胞壁效果最佳，大量的多糖类物质迅速地释放出来，此时灵芝多糖提取率达到最大值3.57%；当温度超过50 ℃时，多糖提取率逐渐下降。原因可能是由于温度过高降低了复合酶的活性，酶解细胞壁效果降低，使多糖提取率下降。试验结果与梁姗等运用复合酶提取胭脂萝卜花青素的结果一致[17]，且其中纤维素酶的最适温度为50 ℃左右，因此复合酶采用50 ℃也是较适宜的。

2.2.1.3 酶解pH 值对灵芝多糖提取率的影响

按照上述单因素试验结果，参照刘晓艳等[18]的试验并加以改进，保持酶解时间80 min、温度时间50 ℃不变，改变酶解pH 值，分析结果得pH 值对灵芝多糖提取效果的影响见图4。

图4 pH 值对灵芝多糖提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis pH on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

由图4 可知，灵芝多糖提取率随pH 值升高呈显著上升趋势；在pH 值为5.35 时，灵芝多糖提取率最大，达到3.67%；而pH 值超过5.35，灵芝多糖提取率逐渐降低。这说明复合酶体系的pH 值为5.35 左右，在这一特定的pH 值，酶的的空间结构较为稳固，从而对酶的构象和酶活的相应变化影响较小[18]；低于或高于5.35 时，酶的空间结构会遭到不同程度的破坏，从而引起酶构象和酶活的相应变化，导致酶活性下降，影响酶与底物的结合，导致多糖提取率下降，也可能是某些酶反应不充分，提取率不高[19]。所以最佳pH 值确定为5.35。

2.2.2 响应面法试验设计及结果

2.2.2.1 响应面法优化试验结果

基于单因素试验结果，选取酶解时间（A）、温度（B）、pH 值（C）进行响应面分析，结果见表5。

表5 响应面试验设计及结果Table 5 Experimental design and results for response surface methodology

以灵芝多糖提取率为响应值（Y），使用软件Design-Expert versi 进行多元回归拟合，计算回归系数，可以得到灵芝多糖提取率对酶解时间（A）、酶解温度（B）和酶解pH 值（C）的多项回归方程：Y=3.574＋0.089×A+0.00125×B+0.22×C－0.22×AB－0.063×AC－0.0075×BC－0.31×A2－0.15×B2－0.017×C2。

2.2.2.2 模型显著性检验

模型显著性检验见表6。

从表6 的模型方差分析中可以看出，本试验的回归方程模型P＜0.05，表明模型具有显著性，说明该回归模拟合理，可以很好地解释响应值；失拟项不显著（P=0.528 7＞0.05），说明该模型对复合酶法提取灵芝多糖工艺的分析和预测是可靠的。模型的一次项C 即酶解pH 值的影响显著，A、B 的影响不显著；二次项中酶解时间的影响显著，酶解pH 值、酶解温度的影响不显著；交互项中酶解时间和酶解温度的影响显著，酶解时间和酶解pH 值的影响不显著，酶解pH 值和酶解温度影响不显著。

表6 回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of the regression model

图5～图7 是根据多元回归程所得到的不同因素之间的交互作用对灵芝多糖提取率影响的响应面图及等高图。从3D 响应面可以直观地看出各变量之间的相互作用关系，而根据2D 等高线图是圆形或者椭圆形则可以看出各变量之间的显著水平[18]。通过3D 图可知，3 个因素的相互作用对灵芝多糖提取率的影响都是先随着数值的增加，响应值缓慢增大，当响应值达到极值后，随着因素的继续增加，响应值逐渐减小；由图5 中的2D 等高线图是椭圆形图可知，酶解温度和酶解时间两个因素交互作用显著，结果与表6 回归模型方差表中的AB 两因素分析结果显著一致。

根据Box-Behnken 试验所得到的数据结果和回归方程，利用Design Expert8.0 软件进行分析灵芝多糖最佳提取工艺，得到回归方程的最大值点是：酶解时间为81.33 min，酶解温度为49.67 ℃，酶解pH 值为5.70，考虑到实际操作性将工艺参数修正为：酶解时间为 81 min、温度为 50 ℃、pH 值为 5.70，模型预测的灵芝多糖提取率最高为3.78%。为了验证其可行性，在此条件下进行3 组验证性试验，灵芝多糖提取率为3.73%，与模型预测值相差0.05%，说明响应面法得到的灵芝多糖提取工艺条件真实可靠。

图5 酶解时间和酶解温度交互作用对灵芝多糖提取率影响的响应面及等高线图Fig.5 Enzymolysis temperature and enzymolysis time as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

图6 酶解pH 值和酶解时间交互作用对灵芝多糖提取率影响的响应面及等高线图Fig.6 Enzymolysis time and pH as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

图7 酶解pH 值和酶解温度交互作用对灵芝多糖提取率影响的响应面及等高线图Fig.7 Enzymolysis temperature and pH as well as their interaction on the extraction yield of Ganoderma lucidum polysaccharide

3 结论

本研究结果发现，复合酶法提取灵芝多糖优于单酶提取，复合酶用量最佳配比为纤维素酶3.5 %、半纤维素酶4.0 %和木瓜蛋白酶3.0 %；然后采用响应面法分析得最佳提取条件：酶解时间为81 min、温度为50 ℃、pH 值为5.70，验证得灵芝多糖的最大提取率为3.73%。本研究结果为较高的粗多糖得率提取工艺提供了理论依据。