化浊通瘀汤干预非酒精性脂肪性肝病大鼠血清肿瘤坏死因子-α和瘦素的变化*

郭化磊,卜理琳,裴 颖,殷宏振,黄 峰

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指无过度摄入酒精等引起的肝脂肪积累,经影像学或组织学检查发现肝脂肪变性的一种疾病,其疾病谱可包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性肝硬化和肝癌[1,2]。流行病学研究显示,在常见的慢性肝病中,NAFLD发病率已超过病毒性肝炎而成为第一位,严重威胁人们的健康,其发病率呈逐年上升并且具有低龄化趋势[3-5]。NAFLD会增加许多疾病的发病率,如胆道和肠道疾病、高血压、心脑血管疾病等,并且NAFLD患者患糖尿病风险高于正常人5～9倍[6,7]。目前,NAFLD的发病机制公认的是“二次打击”学说[8-10],第一次打击导致单纯肝脂肪变性,是由胰岛素抵抗(IR)引起肝脏脂质代谢紊乱引起的,其次打击导致肝细胞凋亡、坏死,是由包括活性氧过剩引起的氧化应激和肿瘤坏死因子(TNF)-α等促炎症细胞因子损伤引起的。中医以整体观念和辨证论治为核心,认为NAFLD主要是由于饮食偏好和过度,损伤脾胃,水湿内停,浊邪内生,加之肥人多气虚懒动,久坐成瘀,终成浊瘀,其病位在肝,涉及脾、胃、肾[11]。本实验建立NAFLD大鼠模型,观察了化浊通瘀汤对动物的干预作用,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与药品 60只健康SPF级雄性SD大鼠,体质量为(180±20)g,购于西安交通大学医学部实验动物中心【合格证号：SCXK(陕)2012-003】,随意进食水。每日明亮与黑暗各半,室内温度为(21±1)℃,空气湿度为(46±5)%。高脂饲料包含10%猪油、5%蛋黄粉、2%胆固醇、0.2%胆酸钠和82.8%基础饲料【北京科澳协力饲料有限公司,合格证号：SCXK(京)2014-0010】。化浊通瘀汤由茯苓20 g、丹参15 g、山楂 15 g、甘草 6 g、泽泻、白术、桂枝、姜黄、桃仁、川芎、决明子、荷叶各10 g组成(西安北京同仁堂大药房)。水飞蓟宾胶囊(国药准字H20040299,天津天士力圣特制药有限公司)。

1.2 动物模型的制备[12]用普通饲料适应性喂养大鼠1 w后,将60只大鼠随机分为对照组12只和模型组48只。给予对照组动物普通饲料喂养,给予模型组高脂饲料喂养,在10 w末,在两组各随机处死3只大鼠,行血生化和肝组织病理学检查,确认模型组大鼠血脂含量上升和病理学检查提示30%以上的肝组织细胞内有大泡性或伴有小泡性脂肪变性,为造模成功。再将模型组动物随机分为模型组、大、中、小剂量化浊通瘀汤组和水飞蓟宾组,每组9只。此时6组动物均改喂普通饲料。

1.3 干预方法 用蒸馏水给对照组和模型组大鼠灌胃。浸泡、煎煮中药各30 min,水煎2次,过滤、浓缩后,放在4℃环境下冷藏备用。在灌胃时,用蒸馏水稀释。根据人与大鼠计量换算公式,大剂量组化浊通瘀汤为30 g.kg-1灌胃、中剂量组15g.kg-1、小剂量组7.5g.kg-1灌胃,水飞蓟宾组为22 mg.kg-1灌胃,1次/d。8 w后,禁食半天,自由饮水,称体质量。首先,用10%水合氯醛3 ml.kg-1腹腔注射麻醉,经腹主动脉采血8 ml,以3000 r/m离心10 min,分离血清。采集血液后,快速打开腹腔,取出肝脏,用生理盐水洗净,称其湿质量,观察形态并计算肝指数(肝湿质量/体质量×100%),取部分肝组织,浸入4%甲醛中固定备用,经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色,在光镜下观察大鼠肝组织形态变化。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件行统计学处理,计量资料以(±s)表示,均数的比较采用t检验,多组间均数的比较采用单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 模型组大鼠肥胖,活动量减少,粪便增多且黏、臭,反应慢;在灌胃给药8 w后,各干预组大鼠上述情况明显好转,其中大剂量化浊通瘀汤和水飞蓟宾干预组大鼠活动量增多,反应较快。模型组大鼠在灌胃操作时,死亡1只。

2.2 各组大鼠体质量和肝指数比较 与模型组大鼠比,各干预组大鼠体质量明显下降(P＜0.01);各干预组大鼠体质量差异无统计学意义(P＞0.05);6组大鼠肝指数变化差异无统计学意义(P＞0.05,表1)。

表1 各组大鼠体质量和肝指数(±s)比较

表1 各组大鼠体质量和肝指数(±s)比较

与模型组比,①P＜0.01

只数 体质量(g) 肝指数对照组 9 487±17.8 2.3±0.1大剂量中药 9 566±19.4① 2.3±0.1中剂量中药 9 577±24.3① 2.4±0.1小剂量中药 9 585±18.5① 2.4±0.2水飞蓟宾 9 568±22.7① 2.3±0.1模型组 8 624±13.4 2.4±0.3

2.3 各组大鼠血清ALT和AST水平比较 模型组大鼠血清ALT和AST水平显著高于对照组(均P＜0.01);各干预组血清ALT和AST水平显著低于模型组(均P＜0.01 或P＜0.05,表2)。

表2 各组大鼠血清AST和ALT水平(±s)比较

表2 各组大鼠血清AST和ALT水平(±s)比较

与模型组比,①P＜0.01

只数 ALT(U/L) AST(U/L)对照组 9 47.3±3.2 94.0±17.5大剂量中药 9 51.3±2.2① 132.2±13.8①中剂量中药 9 64.1±5.5① 152.0±10.8①小剂量中药 9 71.7±2.2 168.6±6.0①水飞蓟宾 9 55.9±2.9① 138.6±12.0①模型组 8 75.7±3.0 194.1±22.9

2.4 各组大鼠血TC、TG和FBG的比较 模型组血清TC、TG和 FBG水平显著高于对照组(均P＜0.01);与模型组相比,干预组TC、TG和FBG水平下降显著(均P＜0.01,表3)。

表3 各组大鼠TC、TG和FBG(±s)比较

表3 各组大鼠TC、TG和FBG(±s)比较

与模型组比,①P＜0.01

只数 TC(mmol/L) TG(mmol/L) FBG(mmol/L)对照组 9 1.1±0.1 0.2±0.1 5.2±0.1大剂量中药 9 1.1±0.1① 0.3±0.0① 5.6±0.1①中剂量中药 9 1.3±0.1① 0.3±0.1① 5.7±0.2小剂量中药 9 1.5±0.1 0.3±0.1① 6.5±0.3水飞蓟宾 9 1.2±0.1① 0.3±0.1① 5.5±0.1①模型组 8 1.7±0.1 0.5±0.1 6.1±0.3

2.5 各组大鼠肝组织病理学变化比较 对照组大鼠肝小叶环绕中央静脉呈放射状分布,肝窦正常,肝细胞索排列整齐,细胞核呈单核或者双核居中央,胞质均匀丰富;模型组大鼠肝小叶周围可见炎性细胞浸润,肝窦变窄,肝细胞索排列无序,肝细胞体积增大,肝细胞内呈现脂滴空泡,细胞核被挤压,甚至消失;小剂量化浊通瘀汤和水飞蓟宾组肝小叶较模型组脂滴空泡减少;大、中剂量化浊通瘀汤处理组动物肝小叶结构可见,肝窦清晰,肝细胞索排列有序,部分肝细胞可见少许脂滴空泡,大部分肝细胞接近正常形态(图1)。

图1 肝组织病理学表现 (HE,100×)

2.6 各组大鼠血清TNF-α和瘦素(leptin)水平比较模型组大鼠血清TNF-α和leptin水平显著高于对照组(P＜0.01);与模型组比,大、中剂量化浊通瘀汤处理组和水飞蓟宾组血清TNF-α和leptin水平明显降低(P＜0.01,表4)。

表4 各组大鼠血清TNF-α和瘦素(±s)比较

表4 各组大鼠血清TNF-α和瘦素(±s)比较

与模型组比,①P＜0.01

只数 TNF-α(pg/mL) 瘦素(ng/mL)对照组 9 23.6±2.2 1.7±0.1大剂量中药 9 30.7±3.5① 2.8±0.2①中剂量中药 9 34.1±4.2① 2.8±0.1①小剂量中药 9 37.0±2.3① 3.2±0.2水飞蓟宾 9 32.5±3.1① 2.9±0.1①模型组 8 44.3±3.9 3.3±0.3

3 讨论

TNF-α来源于肝巨噬细胞的分泌,是导致NASH的主要因子,可通过激活神经鞘磷脂酸来抑制细胞线粒体呼吸链的电子传递过程,使得线粒体内的活性氧生产增多,增强氧化应激反应,诱发并加重IR,促使肝脏炎症发生,导致细胞坏死[13-15]。瘦素又名脂肪抑制素,是一种脂肪细胞分泌的多肽激素,能够阻止游离脂肪酸对非脂肪组织的侵入和积聚。瘦素与胰岛素间具有相互调节作用,高水平瘦素引起胰岛素血症、IR,瘦素能够诱导肝星状细胞(HSC)增殖和活化,是肝纤维化的启动因子之一[16,17]。

NAFLD的病因主要有饮食不节制或喜食肥甘厚味、劳逸过度、情志失调、高龄以及环境等影响,有着明显的家族聚集现象。NAFLD属于中医“痰浊”、“血瘀”、“积聚”、“胁痛”范畴,主要由于饮食偏好与过度,损伤脾胃,脾胃为后天之本,主受纳运化,脾失健运,则水湿内停,浊邪内生,加之肝气不畅,久则瘀化热,且肥人多气虚懒动,气血运行受阻,久坐成瘀,终成浊瘀。浊瘀属阴,阴盛则阳虚,干预宜温阳化浊,行气化瘀。方以化浊通瘀汤,方中桂枝温阳化气,白术健脾燥湿,茯苓,泽泻健脾渗湿,丹参、姜黄、桃仁、川芎活血化瘀、荷叶醒脾,山楂消食化瘀,甘草调和诸药。化浊通瘀汤方系苓桂术甘汤加减,最近研究表明,苓桂术甘汤可抑制代谢综合征大鼠血清TNF-α、瘦素水平升高,缓解高脂血症、肥胖、肝损伤、高血糖,荷叶、山楂、泽泻能降低血压和胆固醇,川芎、丹参、桃仁具有改善肝功能、降酶、降浊等作用[18,19]。水飞蓟宾能够稳定肝细胞膜,保护其酶系统,清除肝细胞内的活性氧自由,使肝脏解毒能力提高,抗脂质过氧化、降血脂、抗炎、调节免疫[20-22]。

化浊通瘀汤通过降低TNF-α和Leptin表达,从而减轻氧应激和细胞因子等相关性损害,改善NAFLD大鼠生化指标,减轻肝脏炎症,改善葡萄糖代谢,实现防治NAFLD的目的。综上所述,本研究为临床干预NAFLD提供了理论依据。