芍药苷对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

汪旭伟， 马沛， 王建伟， 陈玉星

（南阳市第一人民医院普外一科，河南南阳 473010）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，对全球女性健康造成严重威胁。近年来随着手术的改进和化疗技术的迅速发展，患者的生存率、生活质量和预后有较大进步。但由于部分患者出现复发和转移，导致治疗效果不佳，因此寻找有效治疗乳腺癌、降低肿瘤复发率的高效低毒药物是目前研究的热点。芍药苷是从中药芍药中提取的一种单萜类糖苷化合物。研究显示，芍药苷具有降血糖、心血管保护、神经保护、免疫调节和缓解炎症反应等多种药理作用[1-3]，对胃癌、肝癌、结肠癌、皮肤癌、乳腺癌细胞等均有抑制作用[4-7]。已有研究表明，芍药苷通过抑制Notch-1 信号通路、上皮间充质转化（EMT）抑制乳腺癌MCF-7 细胞的增殖、迁移和侵袭[7-8]。为进一步探讨芍药苷对乳腺癌的抑制作用及分子机制，本研究观察了芍药苷对乳腺癌MCF-7 细胞p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）通路的影响，旨在为寻找乳腺癌治疗的新方法提供实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞及培养人乳腺癌细胞系MCF-7购自上海中科院细胞库。MCF-7 细胞接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.2药物及制备芍药苷（纯度：＞98%；CAS：23180-57-6）购自南京百得生物科技有限公司。芍药苷溶解于生理盐水，p38MAPK 通路抑制剂SB203580 溶解于DMSO，0.22 μm 孔径的滤头过滤后使用。

1.3试剂与仪器四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma 公司；Ki67、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、血管内皮生长因子（VEGF）、p38、p-p38、热休克蛋白27（HSP27）、p-HSP27、GAPDH 等兔抗人一抗购自美国CST 公司。DG5031 酶联免疫检测仪购自上海精密仪器仪表有限公司；MDS400光学显微镜购自重庆奥特光学仪器有限责任公司；1703940半干转膜仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4MTT法检测细胞增殖能力取对数生长期的MCF-7细胞，调整细胞浓度至1×104个/mL，每孔接种100 μL 的细胞悬液，培养24 h 后，用含0、5、10、20 μmol/L芍药苷的培养基继续培养。芍药苷0 μmol/L 作为空白对照组，每组设置3 个复孔。培养0、24、48、72、96 h 后，每孔中加10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h。小心吸去培养液，每孔加入75 μL DMSO，振荡10 min。于波长为570 nm处应用酶联免疫检测仪测定各孔吸收值。

1.5划痕实验检测细胞迁移能力将细胞传代培养于12 孔板中，加入不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）的芍药苷后，用10 μL枪头垂直于培养板背面直线划痕。用预冷的PBS洗涤3次后，加入无血清培养液（含10 μg/mL 的丝裂霉素C）进行培养，于0、24 h 进行拍照记录，并计算划痕愈合率。公式：划痕闭合率=（0 h划痕宽度-24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度。

1.6Transwell 法检测细胞侵袭迁移能力取无血清培养基稀释的人工基底膜，加入Transwell 上室，37 ℃风干。取对数生长期的MCF-7 细胞，加入含不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）芍药苷的无血清培养基。上室中加入200 μL 的细胞悬液，下室中加500 μL 的含血清的DMEM 培养基。于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养24 h 后，棉签擦去基质胶和上室细胞，多聚甲醛固定后染色。光学显微镜下计数并拍照，每个样本随机选取5个视野。

1.7蛋白质免疫印迹（Western Blot）法检测细胞增殖和迁移相关蛋白Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF及p38MAPK 信号通路相关蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27 的表达以不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）芍药苷或芍药苷（20 μmol/L）+SB203580（50 μmol/L）作用于对数生长期MCF-7 细胞24 h后，收集细胞，加含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，离心后转移上清。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度，加蛋白上样缓冲液，沸水浴10 min，15 000 r/min 离心10 min，12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白后用半干转膜仪转移蛋白质至PVDF膜。用50 g/L 脱脂牛奶室温封闭蛋白2 h，随后加入一抗（Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、p38、p-p38、HSP27、p-HSP27、GAPDH）于4 ℃孵育过夜，加入对应二抗室温封闭1 h，最后滴加电化学发光（ECL）液曝光显影。使用Image-Pro plus 6.0 软件分析蛋白条带灰度值，最终结果以目标蛋白与内参（GAPDH）的灰度值的比值（p）表示。

1. 8统计方法采用SPSS 18.0 统计软件分析数据。实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组间差异比较采用t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1芍药苷对MCF-7细胞增殖的抑制作用以0、5、10、20 μmol/L 芍药苷作用于MCF-7 细胞1、2、3、4 d 后，结果显示：随着作用时间的延长，芍药苷浓度越大，对细胞增殖的抑制效果越明显（P＜0.01）。表明芍药苷可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力。结果见图1。

图1 芍药苷对MCF-7细胞增殖的抑制作用（MTT法）Figure 1 The inhibiting effect of paeoniflorin on proliferation of MCF-7 cells（by MTT assay）

2.2芍药苷对MCF-7细胞迁移的抑制作用以芍药苷处理MCF-7 细胞24 h 后，结果显示：与空白对照组比较，5、10、20 μmol/L芍药苷组划痕愈合率降低（P＜0.01），且芍药苷浓度越高，划痕闭合程度越低。表明芍药苷可抑制人乳腺癌MCF-7 细胞的迁移能力。结果见图2。

图2 芍药苷对MCF-7细胞迁移的抑制作用Figure 2 The inhibiting effect of paeoniflorin on migration of MCF-7 cells

2.3芍药苷对MCF-7细胞侵袭能力的抑制作用以芍药苷处理MCF-7 细胞24 h 后，结果显示：与空白对照组比较，5、10、20 μmol/L芍药苷组侵袭细胞数减少（P＜0.01），且芍药苷浓度越高，发生侵袭的细胞数目越少。表明芍药苷可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。结果见图3。

2. 4芍药苷对MCF-7细胞增殖和迁移相关蛋白Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表达的影响与空白对照组比较，5、10、20 μmol/L 芍药苷组细胞Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF 的表达水平均显著降低（P＜0.01），且芍药苷浓度越高，效果越明显。结果见图4。

图3 芍药苷对MCF-7细胞侵袭能力的抑制作用Figure 3 The inhibiting effect of paeoniflorin on invasion of MCF-7 cells

图4 芍药苷对MCF-7细胞增殖和迁移相关蛋白Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表达的影响Figure 4 The effect of paeoniflorin on the expression levels of proliferation and migration related proteins Ki67，PCNA，MMP-9，VEGF in MCF-7 cells

2.5芍药苷对MCF-7细胞p38MAPK信号通路相关蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27表达的影响各组细胞p38、HSP27蛋白总表达量没有明显的变化。与空白对照组比较，芍药苷低、中、高浓度组p-p38 和p-HSP27 的表达水平明显上升（P＜0.01），且芍药苷浓度越高，效果越明显。结果见图5。

2.6芍药苷对MCF-7细胞p38MAPK通路抑制后的相关蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表达的影响SB203580后，MCF-7细胞中p-p38和p-HSP27表达水平显著降低，而Ki67、PCNA、MMP-9和VEGF 表达水平均显著上升（均P＜0.01）。SB203580 与20 μmol/L的芍药苷共同处理MCF-7 细胞后，结果显示，细胞中p-p38 和p-HSP27 表达水平显著上升，而Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF 的表达水平均显著降低（均P＜0.01）。结果见图6。

3 讨论

本研究结果显示：不同浓度（5、10、20 μmol/L）的芍药苷作用于MCF-7 细胞后，随着给药浓度和作用时间的增加，芍药苷可逐渐降低乳腺癌细胞活性，抑制乳腺癌细胞增殖。

图5 芍药苷对p38MAPK信号通路相关蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27表达的影响Figure 5 The effect of paeoniflorin on the expression levels of p38MAPK pathway related proteins p38，p-p38，HSP27，p-HSP27

图6 芍药苷对p38MAPK通路抑制后的相关蛋白p38、p-p38、HSP27、p-HSP27、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF表达的影响Figure 6 The effect of paeoniflorin on the expression levels of p38MAPK pathway related proteins p38，p-p38，HSP27，p-HSP27，Ki67，PCNA，MMP-9，VEGF

Ki67和PCNA是检测乳腺癌细胞增殖能力的关键指标。Ki67和PCNA的表达水平越高，乳腺癌增殖能力越强[9]。同时Ki67 和PCNA 常用于乳腺癌的分期和预后观察，对临床有重要的指导作用[10]。本研究的Western Blot 结果显示，不同浓度芍药苷作用于MCF-7 细胞后，细胞中Ki67 和PCNA 的表达水平均显著降低。与MTT 实验结果一致，表明芍药苷可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖。

肿瘤发生转移是其难以治愈的重要原因。肿瘤侵袭是一个多阶段的过程，包括增殖、粘附和运动，其中细胞外基质和细胞基底膜的降解是侵袭过程中的关键步骤[11]。MMP-9 是与肿瘤转移密切相关的蛋白水解酶，能特异性地降解基底膜的重要组成成分Ⅳ型胶原。MMP-9 降解细胞外基质成分后，有助于细胞迁移。VEGF在乳腺癌肿瘤中呈现高表达，有促进乳腺癌转移的作用[12-13]。本研究Transwell 实验结果显示，MCF-7 细胞经不同浓度芍药苷处理后，发生侵袭的细胞数目明显减少。芍药苷处理后，划痕闭合程度明显高于MCF-7 对照组；芍药苷浓度越高，划痕闭合程度越低。Western Blot 结果显示，MCF-7 细胞经芍药苷处理后，细胞中MMP-2 和VEGF 的表达水平显著降低。提示芍药苷可使乳腺癌MCF-7 细胞侵袭和迁移能力降低。

p38 是MAPK 家族中的重要一员，p38 上游的MAPKK 通过磷酸化p38MAPK 使其活化。活化的p38 调控下游多种基因的表达，参与调控细胞生长、分化、凋亡和侵袭等多个生物学过程。在乳腺癌组织中已经发现p38MAPK 磷酸化水平异常降低，而抑制p38MAPK 信号通路后的乳腺癌细胞的生长速度加快，细胞凋亡减少，且影响乳腺癌细胞的迁移[14]。本研究结果显示，MCF-7细胞经芍药苷处理后，细胞中p-p38和p-HSP27的表达水平均显著降低，表明芍药苷可抑制p38MAPK 通路的激活。

为了进一步证实芍药苷是否通过p38MAPK 通路降低乳腺癌MCF-7 细胞的增殖、侵袭和迁移，本研究使用SB203580抑制p38MAPK通路，结果发现，p-p38和p-HSP27的表达水平均显著降低。当SB203580与芍药苷共同作用于MCF-7细胞后，pp38 和p-HSP27 的表达水平均显著上升，而Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF 的表达水平均显著降低。提示芍药苷可通过激活p38MAPK 通路抑制MCF-7细胞增殖和迁移相关蛋白表达，从而抑制MCF-7细胞的增殖和迁移。

综上所述，芍药苷可抑制人乳腺癌MCF-7 细胞的增殖、侵袭和迁移，其机制可能与调控p38MAPK 通路的激活有关。本研究下一步将构建乳腺癌抑制瘤裸鼠模型，观察芍药苷对实体肿瘤生长和转移能力的影响。