桑皮止咳方对呼吸道合胞病毒感染后咳嗽小鼠气道神经源性炎症的影响

王楠， 白晓红， 刘芳， 修婵， 宋金婷， 盛晓丹， 王敏

（1.辽宁中医药大学，辽宁沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁沈阳 110032）

感染后咳嗽（post-infectious cough，PIC）[1]是指呼吸道感染急性期症状消失后，仍长时间咳嗽，持续时间一般为3～8周。PIC是儿科常见的呼吸系统疾病，亦是引起小儿慢性咳嗽的原因之一。国内外研究表明，PIC占慢性咳嗽的21.72%，在中国儿童慢性咳嗽病因中居第3 位[2]。尽管临床上感染后咳嗽比较常见，但其发病机制复杂，除与气道炎症、气道黏膜损伤、气道高反应、咳嗽反射敏感性增高相关，还与神经、内分泌及免疫系统密切相关，各因素之间相关作用，形成复杂的病因网络。气道神经源性炎症是引起气道敏感性增高的重要因素，而神经生长因子（NGF）是调控气道神经源性炎症的关键介质[3]。

本研究所用的桑皮止咳方是以《小儿药证直诀》的泻白散和《医学心悟》的止嗽散化裁而来，具有清泻肺中伏火，兼疏散在表之风邪、化痰止咳之功效，临床应用20 余年，疗效显著。经前期的临床和实验研究证实，该方具有良好的宣肺止咳、化痰平喘、解热，减轻气道炎症反应的作用[4-6]。但其有关气道神经源性炎症的机制作用尚不明确，基于此，本研究观察了桑皮止咳方对呼吸道合胞病毒（RSV）感染后咳嗽小鼠模型肺组织中NGF 表达水平的影响，以探讨桑皮止咳方的干预作用及相关气道神经源性炎症机制，为该方的临床应用提供理论和实验依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1. 1动物与病毒SPF 级6 周龄BALB/c 小鼠96只，雌性，体质量18～20 g，均购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物质量合格证号：SCXK（辽）2015-0001。实验动物的使用过程中严格遵守3R 原则，经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准[伦理审批编号：21000092018020]。RSV Long株，由武汉大学病毒研究所提供。

1.2药物与试剂桑皮止咳方组成中桑白皮、地骨皮、苦杏仁、桔梗等中药材均购于辽宁中医药大学附属医院草药局；孟鲁司特钠咀嚼片（英国）（杭州默沙东制药有限公司分装），国药准字J20130053，规格：每片4 mg。辣椒素（批号：A3278）、NGF 抗体免疫组织化学试剂盒（批号：ab52918）均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3仪器超声雾化器（江苏鱼跃公司，型号：402AI）；离心机（德国Eppendorf 公司，型号：5804R）；显微镜（日本Olympus 公司，型号：CX-41）；ATP 700（ST）电脑全自动脱水机（澳大利亚Hestion 公司）；Epoch 酶标仪（美国BioTek 仪器有限公司）；PowerPac Basic电泳仪（美国伯乐公司）。

1. 4分组、造模与给药（1）分组：按照随机数字表将96 只小鼠分为正常组、模型组、孟鲁司特钠组、桑皮止咳方低剂量组、桑皮止咳方中剂量组、桑皮止咳方高剂量组，每组16 只。（2）RSV感染后咳嗽模型的复制方法：除正常组外，其他组别小鼠乙醚浅麻醉下经两侧鼻孔缓慢滴入RSV Long株病毒液，50 μL/只。正常组在同等条件下接种等量不含病毒的DMEM，每日1 次，连续接种3 d[7-9]。感染后第13 天以辣椒素雾化刺激，观察RSV 感染小鼠出现频繁喷嚏、口鼻分泌物增多、腹肌抽搐、伸出前脚、颈部伸向前、张口等特征性体位的情况。（3）给药：从感染后第14 天起各组分别灌胃给药，给药剂量按“人和动物按体表面积折算的等效剂量折算表”折算。孟鲁司特钠组小鼠给予0.08 g·mL-1灌胃，桑皮止咳方低剂量组小鼠给予0.5 g·mL-1灌胃，桑皮止咳方中剂量组小鼠给予1.0 g·mL-1灌胃，桑皮止咳方高剂量组给予2.0 g·mL-1灌胃。每只小鼠给予0.2 mL·d-1灌胃。正常组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃。连续14 d。同时，观察小鼠的一般状态。

1.5观察指标与方法

1.5.1 咳嗽敏感性的测定 末次（即感染后第28天）给药30 min 后，将小鼠置于5 L 密闭雾化箱中，以雾化浓度为1×10-4mol/L的辣椒素溶液雾化2 min，再观察3 min，记录小鼠的咳嗽潜伏期及次数。

1.5.2 苏木素—伊红（HE）染色观察肺组织病理变化 取经多聚甲醛固定后的小鼠肺组织，经石蜡包埋，切片，烘片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，采用HE染色等处理，封片。光镜下观察肺组织炎性细胞浸润情况。

1.5.3 免疫组织化学法检测肺组织中NGF蛋白的表达 取固定好的肺组织，常规石蜡包埋、制片（0.45 μm）。枸橼酸修复后，加内源性过氧化物酶孵育10 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗净后加体积分数10%胎牛血清孵育20 min，加NGF 抗体（1∶300）4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次3 min，加酶标山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物孵育20 min。PBS 冲洗3次，每次3 min，加入新鲜配制的DAB显色剂，显色3 min 后，流水冲洗5 min，苏木素复染3 min，流水冲洗5 min。梯度酒精、二甲苯脱水透明，封片后光镜下观察。

1.5.4 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测肺组织中NGF蛋白的表达 将小鼠肺组织自-80 ℃冰箱中取出，匀浆，加入裂解液裂解30 min 后，以12 000 r/min 4 ℃离心15 min。取上清，经BCA 蛋白定量后，加入蛋白上样缓冲液，沸水中变性5 min，按每孔60 μg蛋白量上样。12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），恒压80 V、120 V 电泳分离蛋白，恒流200 mA，50 min后将蛋白转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，丽春红染色，脱脂奶封闭2 h。NGF（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000）等一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次后，二抗孵育1 h，TBST 洗膜3次。将条带放入曝光仪，加入电化学发光（ECL）液，进行曝光。

1.6统计方法采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般情况正常组小鼠精神状态良好，反应灵敏，皮毛柔顺有光泽，进食、饮水、活动均正常，体质量正常增长；模型组小鼠精神萎靡，反应较为迟钝，活动少，毛色枯黄暗淡，进食、饮水减少，体质量减轻。

2. 2各组小鼠咳嗽敏感性比较表1 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠咳嗽潜伏期明显缩短（P＜0.01），咳嗽次数显著增多（P＜0.01）。提示PIC 造模成功。与模型组比较，桑皮止咳方低、中、高剂量组和孟鲁司特钠组小鼠咳嗽潜伏期明显延长、咳嗽次数显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），且桑皮止咳方的作用效果呈剂量依赖性。

表1 各组小鼠咳嗽敏感性比较Table 1 Comparison of the cough sensitivity of mice in various groups （±s）

表1 各组小鼠咳嗽敏感性比较Table 1 Comparison of the cough sensitivity of mice in various groups （±s）

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.05，③P＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组孟鲁司特钠组桑皮止咳方低剂量组桑皮止咳方中剂量组桑皮止咳方高剂量组N/只16 16 16 16 16 16潜伏期（t/s）121.74±6.84 55.72±8.29①104.66±6.82③67.19±7.77③97.60±5.46③109.65±8.95③咳嗽次数（n/次）31.44±4.35 74.44±6.26①40.13±5.92③68.75±6.59②50.19±4.87③41.81±5.09③

2.3各组小鼠肺组织病理变化比较图1 结果显示：正常组小鼠肺组织、支气管无炎症细胞浸润，肺泡壁上皮完整，支气管壁未见增厚。模型组小鼠肺泡壁上皮细胞受损，肺泡壁、支气管壁明显增厚，肺间质可见大量淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性细胞浸润。与模型组比较，桑皮止咳方低、中、高剂量组和孟鲁司特钠组小鼠肺组织损伤减轻，肺泡壁上皮受损轻微，支气管壁略见增厚，肺间隔轻度增宽，炎症细胞浸润不明显。

2.4各组小鼠肺组织中NGF蛋白表达量比较表2、图2 结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺组织NGF 表达量均显著上调（P＜0.01）；与模型组比较，桑皮止咳方低、中、高剂量组和孟鲁司特钠组小鼠肺组织NGF表达量下降（均P＜0.01），且桑皮止咳方的作用效果呈剂量依赖性。

2. 5各组小鼠肺组织中NGF蛋白相对表达量比较图3结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺组织NGF 蛋白表达量显著上调（P＜0.01）；与模型组小鼠肺组织比较，桑皮止咳方低、中、高剂量组和孟鲁司特钠组小鼠肺组织NGF蛋白表达量下降（均P＜0.01），且桑皮止咳方的作用效果呈剂量依赖性。

图1 各组小鼠肺组织病理变化比较（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of the pathological features of lung tissue in mice of various groups（by HE staining，×400）

表2 各组小鼠肺组织中NGF蛋白表达量比较Table 2 Comparison of the relative expression level of NGF in lung tissue of mice in various groups （±s）

表2 各组小鼠肺组织中NGF蛋白表达量比较Table 2 Comparison of the relative expression level of NGF in lung tissue of mice in various groups （±s）

①P＜0.01，与正常组比较；②P＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组孟鲁司特钠组桑皮止咳方低剂量组桑皮止咳方中剂量组桑皮止咳方高剂量组N/只16 16 16 16 16 16 NGF（A/μm2）91 794.38±8 816.41 816 286.40±88 872.49①317 594.60±50 345.16②647 733.36±70 229.77②481 081.24±46 261.27②385 223.33±35 981.07②

图2 各组小鼠肺组织NGF阳性表达比较（免疫组织化学染色，×400）Figure 2 Comparison of the positive expression of NGF in lung tissue of mice in various groups（by immumohistochemical staining，×400）

3 讨论

感染后咳嗽（PIC）是一种常见的呼吸系统疾病，绝大部分由呼吸道病毒感染引起，其中呼吸道合胞病毒（RSV）最为常见。RSV感染可以引起气道上皮细胞坏死、脱落，使感觉神经末梢充分暴露，炎症介质大量释放，这些炎症介质作用于气道平滑肌细胞、上皮细胞等，引起气道平滑肌痉挛，从而出现咳嗽敏感性增高、神经源性炎症、气道高反应等[10]。可见，气道神经源性炎症在PIC的发生发展中发挥重要的作用。

NGF 作为连接神经系统及免疫系统的桥梁，对神经细胞的生长、分化、调节均起到调控的作用，并且对免疫系统和炎症网络动态平衡也起到重要的调节作用[11]。NGF 作为神经和免疫双调控因子，通过诱导神经炎症反应参与了PIC 的发病[10]。本研究结果显示，RSV感染后咳嗽小鼠肺组织中NGF 表达明显升高，经孟鲁司特钠和桑皮止咳方的干预后NGF蛋白表达明显下降。

PIC属中医学“慢性咳嗽”范畴。小儿慢性咳嗽多为急性呼吸道感染后，外邪未尽，郁热内留于肺，导致咳嗽缠绵。而且内有郁热的小儿更易于招致外邪，患儿常兼外感风邪导致咳嗽时轻时重。桑皮止咳方是以《小儿药证直诀》的泻白散和《医学心悟》的止嗽散化裁而来，由蜜桑白皮、地骨皮、苦杏仁、桔梗等中药组成。方中：蜜桑白皮为君，泻肺止咳，利水消肿；地骨皮为臣，凉血除蒸，清肺降火。君臣配伍，既清肺中实火又泻肺中郁热而止咳。苦杏仁降气平喘，桔梗宣肺祛痰，两药升降共筑，调节肺之宣发肃降。诸药相伍，共奏清肺经郁热，泻肺中虚火，疏散在表未尽之余邪，恢复肺之正常宣肃功能，而达到止咳功效。纵观全方，既能清泻肺中实火又可泻肺中伏火，兼有疏散在表之风邪、化痰止咳之功效，配伍得当，效果益彰。经前期的药理实验研究证实，该方具有明显的镇咳、抗炎和免疫调节作用。本研究首先通过辣椒素诱咳实验对PIC 模型小鼠咳嗽敏感性进行了测定，结果显示：模型小鼠咳嗽潜伏期明显缩短，咳嗽次数明显增多，咳嗽敏感性增加；分别给予孟鲁司特钠和桑皮止咳方治疗后，桑皮止咳方低、中、高剂量组和孟鲁司特钠组小鼠咳嗽潜伏期显著延长，咳嗽次数显著降低，咳嗽敏感性降低。这进一步支持了桑皮止咳方对PIC 主症咳嗽治疗作用确切的结果。以免疫组织化学、Western Blot 法检测小鼠肺组织中NGF 蛋白表达的结果显示，模型组NGF 表达量显著增高，桑皮止咳方低、中、高剂量组和孟鲁司特钠组NGF 表达量均明显降低，表明桑皮止咳方能抑制PIC小鼠肺组织NGF的表达。

综上所述，桑皮止咳方能显著降低RSV 感染后小鼠咳嗽敏感性，其机制可能与抑制肺组织NGF 蛋白的表达，减少肺组织的炎性浸润，降低气道神经源性炎症，进而调控神经与免疫系统的交互作用有关。

图3 各组小鼠肺组织中NGF蛋白相对表达量比较Figure 3 Comparison of the relative expression level of NGF in lung tissue of mice in various groups（±s，p）