宣肺调肠方对脓毒症大鼠肠道损伤的修复作用及机制研究

章国军， 李健

（1.广东省广州市花都区人民医院重症医学科，广东广州 510800；2.广东省中医院，广东广州 510120）

脓毒症是由感染或高度可疑感染灶引起的全身炎症反应综合征，病死率高[1]。肠道是脓毒症时脏器损害的重要靶器官。肠道功能障碍更是脓毒症的“始动因素”，也是由脓毒症发展至脏器功能障碍综合征（multiple organs dysfunction syndrome，MODS）的重要因素之一[2]。有研究表明，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（pAMPK）可抑制机体炎症反应，pAMPK的高低与炎症分子表达水平的高低之间存在密切的联系[3]。宣白承气汤是“肺肠同治”的经典方。已有研究表明，宣白承气汤可有效抑制脓毒症患者的炎症反应及氧化应激反应[4]。本研究应用以宣白承气汤为基础方进行加减的宣肺调肠方治疗脓毒症大鼠，并以宣白承气汤为阳性对照，旨在探究宣肺调肠方修复脓毒症肠道损伤的作用及其pAMPK机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠36只，体质量（200±20）g，购自南方医科大学实验动物中心，动物质量合格证号：44002100004733。实验单位：广东省中医药科学院。给予大鼠标准正常饮食，自由摄食饮水。

1.2 药物、试剂与仪器 宣肺调肠方由生石膏30 g、生大黄10 g、杏仁10 g、瓜蒌皮15 g、枳实15 g、厚朴15 g、黄芪30 g组成。宣白承气汤由生石膏15 g、大黄9 g、杏仁6 g、瓜蒌4.5 g组成。上述中药材均由广东省中医院提供，由广东省中医院李健教授、马世玉副研究员鉴定。大鼠白细胞介素6（IL-6）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；pAMPK（Thr172）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）活性试剂盒（南京建成生物工程研究所）；内毒素（LPS）（美国Sigma公司）。JS-Power300电泳仪（上海培清公司）；Multiskan Mk3酶标仪（美国Thermo公司）；UV-754型分光光度计（上海第三分析仪器厂）。

1.3 分组、模型复制与给药 适应性喂养3 d后，将大鼠按体质量编号根据随机数字表分为正常组，模型组，宣肺调肠方高、中、低剂量组，宣白承气汤组，每组6只。宣肺调肠方高、中、低剂量组及宣白承气汤组在造模开始前连续3 d给予大鼠相应的药物灌胃，正常组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃。每只大鼠灌胃体积均按10 mL/kg（体质量）计算。宣肺调肠方成人（按60 kg体质量计算）给药剂量是125 g，大鼠给药剂量按成人与大鼠体表面积法[5]进行换算，为12 g·kg-1·d-1（中剂量），高、低剂量分别为中剂量的2倍和1/2倍 ， 即 24、 6 g·kg-1·d-1。按相同的方法[5]换算，宣白承气汤组大鼠给药剂量为3.5 g·kg-1·d-1。参照Yeh等[6]设计的方法复制脓毒症模型。操作步骤：取100 mg LPS用体积分数0.9%无菌生理盐水6.67 mL充分混匀，即可得浓度为15 mg/mL的LPS溶液，于4℃冰箱中储存。造模开始时，将大鼠固定，用酒精擦拭大鼠尾部至尾静脉清晰可见，用1 mL注射器吸取LPS溶液（吸取量按1 mL/kg大鼠体质量计算），将注射器针尖插入大鼠尾静脉，先回抽至针管中可见红色静脉血，再将LPS溶液注入血管中，退针，用无菌棉签轻轻按压进针部位2 min至未见出血，则造模完成。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 标本取材及处理 造模后3 h各组动物无菌条件下麻醉、开腹，经腹主动脉采血，离心20 min，分离血清，放入-20℃冰箱中保存。取近回盲端回肠组织2～3 cm，放入4℃等渗生理盐水中冲洗，留取标本2份。一份用体积分数10%甲醛固定，另一份立即进行组织匀浆。

1.4.2 采用双抗体夹心ELISA法检测血清IL-6水平 严格按照试剂盒说明书操作。简要步骤：将标准品按倍比稀释原则稀释放入EP管中，制作标准曲线。在96孔板加样后于37℃条件下温育2 h，反复洗涤5次后，加酶封闭温育，加入底物，避光显色15～30 min。加入终止液50 μL，待液体颜色变成黄色，静置混匀5 min。将已终止反应的96孔板放入酶标仪中，在450 nm波长处检测各孔吸光度值，再计算样品IL-6质量浓度。

1.4.3 采用黄嘌呤氧化酶法检测血清MDA、SOD活性 严格按照试剂盒说明书操作。简要步骤：取各组样本血清25 μL加入测定管，用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40 min，加入显色剂，混匀，室温放置10 min。于波长550 nm处，用1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色，测吸光度值，计算血清MDA、SOD含量。

1.4.4 苏木素—伊红（HE）染色观察回肠组织形态学改变 将回肠组织从体积分数10%甲醛取出后切成1 cm×0.8 cm×0.2 cm大小的组织块，再固定2 h后使用浓度递增的酒精脱水，酒精浓度依次为70%、80%、90%、95%、无水酒精，二甲苯透明，石蜡包埋。以石蜡包埋块切片，厚度为5 μm，切片后将石蜡切片置于二甲苯中溶解石蜡。再使用浓度递减酒精水化，酒精浓度依次为无水酒精、95%、90%、80%、70%，蒸馏水冲洗后进行常规HE染色。光镜下观察各组大鼠回肠组织形态学变化。

1.4.5 蛋白免疫印迹（Western Blot）方法检测回肠组织pAMPK、AMPK的表达水平 使用蛋白提取试剂盒提取回肠匀浆总蛋白，蛋白标本与蛋白上样缓冲液混合后经热变性处理，样品经8%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白。一抗pAMPK、AMPK稀释浓度为1∶1 000，二抗浓度为1∶30 000。以GAPDH作为内参照，计算pAMPK、AMPK蛋白的相对表达量（p）。

1.5 统计方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，不同组间比较，若方差齐，采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若方差不齐则用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模情况 模型大鼠出现活动减少，摄食减少，不合群，嗜睡，蜷缩，竖毛，腹胀，腹泻，眼角出现分泌物等。解剖后可观察到大鼠腹腔大量血脓性物渗出，小肠肠管明显扩张、水肿，肝脏表面可见瘀点，肺脏充血明显。证明脓毒症模型制备成功。

2.2 各组大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比较 表1结果显示：与正常组比较，模型组血清IL-6含量、MDA活性明显升高，SOD活性明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，宣肺调肠方高、中剂量组血清IL-6含量、MDA活性明显降低，宣肺调肠方高剂量组SOD活性明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），且宣肺调肠方高、中、低剂量组对血清IL-6含量、MDA活性的降低作用和对SOD活性的升高作用具有剂量依赖性。

表1 各组大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比较Table 1 Comparison of the serum IL-6，MDA and SOD levels in various groups （）

表1 各组大鼠血清IL-6、MDA、SOD水平比较Table 1 Comparison of the serum IL-6，MDA and SOD levels in various groups （）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组宣肺调肠方高剂量组宣肺调肠方中剂量组宣肺调肠方低剂量组宣白承气汤组SOD[J/（U·mL-1）]144.309 5±6.149 103.949 2±4.234①116.519 9± 6.038①②114.980 1±4.769①110.615 1±7.573①109.932 5±9.143①N/只6 6 6 6 6 6 IL-6[ρ/（μg·mL-1）]1.108±0.487 2.779±0.655①1.208±0.537②1.219±0.828②1.425±0.948 1.577±0.871 MDA[c/（nmol·mL-1）]10.374±1.079 17.294±1.108①13.089± 0.886①②14.649± 1.481①②15.912±0.982①15.975±1.004①

2.3 光镜下各组大鼠回肠组织形态学变化比较 图1结果显示：正常组大鼠回肠组织结构正常，肠绒毛排列整齐，绒毛结构清晰，无变性坏死，未见炎症细胞浸润；模型组大鼠肠绒毛明显水肿、伴充血、坏死，有炎症细胞浸润，肠腔可见大量炎症细胞；各治疗组大鼠回肠组织结构基本正常，肠绒毛见不同程度水肿和间质炎症。

2.4 各组大鼠回肠组织pAMPK、AMPK蛋白表达比较 图2、表2结果显示：与正常组比较，模型组大鼠回肠组织pAMPK蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，宣肺调肠方高、中、低剂量组pAMPK蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），且升高作用呈剂量依赖性。各组AMPK蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

本研究按Yeh等[6]造模方法复制脓毒症大鼠模型的结果显示，与正常组比较，光镜下观察模型组大鼠回肠组织明显充血水肿，大量炎性细胞浸润，表明脓毒症大鼠模型制备成功。

肠功能障碍是脓毒症发生发展的重要因素。肠功能障碍的机制极其复杂，目前认为主要与以下因素有关：肠黏膜屏障的损伤[7]，细菌/内毒素易位[8]，胃肠激素的影响，谷氨酰胺的缺乏[9]，其中细菌/内毒素易位是其重要机制之一。肠道内细菌/内毒素易位时，可导致各种炎性介质大量释放及补体激活。同时，在全身炎症反应及应激状态下，机体产生大量的氧自由基，可直接导致细胞损伤或死亡，而氧自由基与炎症应答之间形成互相活化、反馈放大的机制，从而互相增强，进而造成全身组织和器官损害，发生MODS[10]。炎症因子IL-6主要由单核细胞产生，是机体炎症反应强弱的重要检测指标[11]。MDA是氧化应激反应时的一个重要指标，它与氧化应激反应的严重程度直接相关；SOD是一种重要的抗氧化金属酶，其活性可衡量体内酶类抗氧化系统防御自由基损伤的能力，亦可反应机体氧化应激反应的严重程度。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是高度保守的蛋白激酶，在真核生物细胞中广泛存在，具有调控细胞组织代谢和能量作用[12]，被称为“细胞能量调节器”[13]。体外实验发现，LPS诱导的炎症反应可通过AICAR激活AMPK抑制炎症反应[14]。

图1 各组大鼠回肠组织形态学变化比较（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological changes of ileum tissue in various groups（by HE staining，×200）

图2 各组大鼠回肠组织pAMPK、AMPK蛋白Western Blot电泳条带Figure 2 The Western Blot electrophoresis strips of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups

目前治疗脓毒症无特效药，而中医药治疗脓毒症已成为重要的手段。前期研究[15]发现宣白承气汤治疗肠源性脓毒症有一定的疗效。本研究所用宣肺调肠方，是广东省中医院重症医学科通过多年脓毒症的临床研究，将传统方剂宣白承气汤中的杏仁、石膏、瓜蒌、大黄的用量加大，再加入具有行滞消积作用的枳实、厚朴，益气补虚的黄芪。该方具有清肺脏之热邪，泻大肠之秽浊，补脏腑之虚的功效，诸药合用，共奏通腑泻下、清热解毒、益气扶正、凉血活血之功。本研究结果显示，与模型组比较，宣肺调肠方组回肠组织水肿充血症状减轻，IL-6含量降低，SOD活性增强，pAMPK蛋白表达增多，提示宣肺调肠方具有保护肠道损伤的作用。推测其作用机制可能是宣肺调肠方激活了AMPK通路，从而达到抑制脓毒症炎症反应，加强抗氧化应激的作用。

表2 各组大鼠回肠组织pAMPK、AMPK蛋白表达比较Table 2 Comparison of the expression levels of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups（，p）

表2 各组大鼠回肠组织pAMPK、AMPK蛋白表达比较Table 2 Comparison of the expression levels of pAMPK and AMPK in ileum tissue of various groups（，p）

①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别正常组模型组宣肺调肠方高剂量组宣肺调肠方中剂量组宣肺调肠方低剂量组宣白承气汤组AMPK/GAPDH 0.742 7±0.354 3 0.542 2±0.231 7 0.805 7±0.252 8 0.696 4±0.047 5 0.626 7±0.066 5 0.542 2±0.113 1 N/只3 3 3 3 3 3 pAMPK/GAPDH 0.775 7±0.018 5②0.367 2±0.104 8①0.741 6±0.047 2②0.642 2±0.112 8②0.577 2± 0.043 4①②0.564 5±0.195 3

本研究因后期经费不足，从各组大鼠中随机选择了3只进行Western Blot法检测蛋白表达。本研究收集的样本较少，望在以后的研究中加大样本量、增加设置不同时间点、增加不同脏器组织的检测，以进一步阐明宣肺调肠方的肠道保护作用，为此方在临床应用的有效性提供理论依据。