湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的巢式PCR检测分析①

赵丽宏 刘建荣 张曼其 刘伟清 吴 凡 冯学娟

(广东省湛江农垦科学研究所 广东湛江524086)

柑橘黄龙病（HLB）是柑橘生产上的毁灭性病害，是由一种革兰氏阴性细菌引起的，最早是在广东省潮汕地区被发现的。该病害主要发生在非洲、亚洲、美洲和大洋洲等50多个柑橘种植国家［1］。中国柑橘黄龙病主要发生在江西、云南、四川、福建、广东等11个柑橘生产省（市、自治区）［2］。该病害主要通过柑橘木虱、带病的苗木、接穗等传播，能侵染柑橘属、枳属、金柑属和九里香等多种芸香科植物［3-4］。由于黄龙病的病原菌是较难培养的细菌，因此分子水平上的研究一直无法深入开展，直至2009年才获得黄龙病亚洲种全基因组序列［5］。早期通过观察植株典型症状来进行黄龙病的田间形态学鉴定，具有一定的主观性。随着分子生物学的发展，目前主要采用PCR技术来检测黄龙病的病原菌。Nested PCR是一种变异的聚合酶链式反应。程保平等［6］使用常规和巢式PCR 2种方法分别对同一样本进行检测，发现巢式PCR的检测灵敏度大于常规PCR。

红江橙是新会甜橙和福桔嫁接后形成的嵌合体植株，是一个早结、丰产、品质良好的红肉甜橙新品种［7］，同时也是湛江农垦的特色和名优产品。由于其果肉红润、味道香浓、口感宜人，果皮薄滑、光亮，品质上乘，成为中国出口创汇水果佳品［8］。红江橙是红江农场科技人员在1971年发现并培育而成的变异单株，于1972年开始选育种植，到1990年种植面积已达到1.33万hm2［9］。后来由于黄龙病的大面积发生，红江橙种植面积下降至0.19万hm2，对湛江农垦红江橙产业造成很大的经济损失，直到2008年才开始恢复种植［10］。柑橘黄龙病的发生，大幅降低了红江橙的产量和品质，发病严重时会使整个果园绝收，造成巨大的经济损失。

针对柑橘黄龙病缺乏有效防治药剂和抗病品种，目前主要采取以预防为主的方式来控制黄龙病的发生和蔓延［11］。因此，及时了解湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的发生情况，明确病害发生的原因，对于该病的有效防控具有重要的作用。2014年，黄勤知等［12］就已经对红江农场的少部分果园进行黄龙病的抽查，但这已是几年前的事了，目前很有必要对湛江农垦红江橙主产区的果园进行黄龙病发病率的抽查。2016～2018年，抽样调查了湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的发生情况，对这2个果园红江橙黄龙病进行检测分析，为今后该病的有效防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理

2016～2018年，在红江农场38队红江橙果园采集具有黄化、斑驳等症状的叶片样本198个，于广垦（湛江）红江橙农业科技有限公司横江红江橙果园采集具有上述相同症状的叶片样本107个，共305个样本。所采集的样本按症状分类、拍照和整理后，取其叶片，用液氮研磨至粉末状，放-20℃保存待用。所用阳性对照为经测序验证的感病红江橙叶片，阴性对照采自湛江农垦科学研究所脱毒的红江橙母本园。

1.2 引物

根据柑橘黄龙病病原亚洲株系16S rDNA设计Nested PCR引物［13］，由上海生工生物工程技术有限公司合成。其中nested PCR的外侧引物为P2-1（5'-TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAGC-3'）， P2-2（5'-AGAATTCGACTTAATCCCCACCT-3'）；内侧引物 P3-1（5'-GCGTTCATGTAGAAGTTGTG-3'），P3-2（5'-CCTACAGGTGGCTGACTCAT-3'）。

1.3 检测方法

1.3.1 叶片DNA的提取

用解剖刀切取靠近中脉的部分叶片组织，按照上海生工《植物基因组DNA提取试剂盒》的操作方法提取，提取的DNA置于-20℃冰箱备用。

1.3.2 Nested PCR检测

以提取的红江橙叶片总DNA为模板，反应体系为20μL，进行nested PCR扩增。第一轮与第二轮的反应体系一样，其中包括10×PCR buffer（含Mg2+） 2 μL， 2.5 mmol/L each dNTP 1.6 μL，1μmol/L 引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.1 μL，模板DNA 1μL，H2O 13.3μL。使用引物P2-1/P2-2进行第一轮PCR扩增，然后取1μL第一轮PCR产物做第二轮PCR的模板，使用引物P3-1/P3-2进行第二轮PCR扩增。PCR扩增程序：95℃预变性5 min；94℃变性40 S，55℃退火40 S，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。最后进行电泳检测，在凝胶成像系统下观察记录结果。

2 结果与分析

2.1 部分样本的PCR检测结果

巢式PCR结果显示，目的片段大小为400 bp。根据PCR扩增产物有无DNA特异扩增条带（400 bp）来判断样本中是否含有黄龙病的病原菌。若PCR为阳性，说明样本中含有黄龙病的病原菌；若PCR为阴性，说明样本中没有检测出黄龙病的病原菌。图1为2016年红江农场38队部分红江橙叶片样本 的检结果。

图1 2016年红江农场38队果园部分红江橙叶片样本PCR扩增电泳图

2.2 2016～2018年湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病总的发生情况

305个叶片样本黄龙病的检测结果见表1。从表1中可以看出，305个样本中有162个样本呈阳性，黄龙病（HLB）的检出率为53.1%。其中红江农场果园HLB的阳性检出率较高，为55.6%。

表1 2016～2018年湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的检测结果

2.3 不同单位红江橙HLB的发生情况

从表2、表3中可看出，不同采样地点、不同采样时间黄龙病的阳性检出率存在一定的差异。从表2可看出，红江农场38队红江橙果园198个叶片样本中有110个样本呈阳性，HLB的检出率为55.6%。

表2 2016-2018年红江农场38队红江橙果园黄龙病的检测结果

同时也可看出，红江农场38队红江橙果园HLB的阳性检出率逐年增加，2018年HLB的阳性检出率高达70.7%。

从表3可看出，广垦（湛江）红江橙农业科技有限公司横江红江橙果园107个叶片样本中有52个样本呈阳性，黄龙病的检出率为48.6%；2017年黄龙病的阳性检出率最高，为56.7%，2018年黄龙病的阳性检出率较低，为42.9%。

表3 2016～2018年广垦（湛江）红江橙农业科技有限公司横江红江橙果园黄龙病的检测结果

造成该公司2018年黄龙病的阳性检出率低于往年的原因可能是由于柑橘黄龙病的病原菌主要寄生于柑橘的维管束细胞中，病原菌在柑橘体内的含量较少、分布不均匀，使得所采集叶片中病原菌含量较少，造成PCR结果出现假阴性。

2.4 不同年份红江橙HLB的发生情况

2016～2018年湛江农垦红江农场38队红江橙果园和广垦（湛江）红江橙农业科技有限公司横江红江橙果园均有不同程度的黄龙病发生，且阳性检出率逐年增加，2018年黄龙病的阳性检出率高达62.4%。具体检测结果见表4～6。

表4 2016年湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的检测结果

表5 2017年湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的检测结果

表6 2018年湛江农垦红江橙主产区2个果园黄龙病的检测结果

3 讨论与结论

柑橘黄龙病（HLB）是一种细菌性病害，潜伏期长，且病原菌在柑橘组织中分布不均匀，这给黄龙病的早期检测及防控带来了困难［14-15］。加强柑橘黄龙病的检测是预防黄龙病发生的基础［16］，黄龙病可防控，但不可治疗，这就需要加强该病害的早期检测。因此，采用快速、准确、适用于大批量样本的检测技术对柑橘果园进行定期的监测，对防治该病害的传播蔓延具有极其重要的作用。

本研究明确了柑橘黄龙病在湛江农垦红江橙主产区2个果园中的分布及危害情况，为有效防控黄龙病提供科学依据。2016～2018年，笔者对这2个果园的红江橙叶片样本进行黄龙病的系统调查，采用nested PCR技术对具有黄化、斑驳等症状的305个叶片样本进行黄龙病的检测。结果发现，305个样本中有162个样本呈阳性，黄龙病的检出率为53.1%。红江农场38队红江橙果园黄龙病的阳性检出率为55.6%，且该果园黄龙病的阳性检出率逐年增加，这一研究与黄勤知等［12］的研究是一致的；广垦（湛江）红江橙农业科技有限公司黄龙病的阳性检出率也很高，达到了48.6%，这说明黄龙病已在湛江农垦红江橙主产区的这2个果园普遍发生且危害较严重，同时也表明，按照黄龙病的典型症状如斑驳、黄化等进行采样，阳性检出率也很高。由于柑橘黄龙病是一种韧皮部革兰氏阴性细菌，在柑橘组织中分布不均匀且含量较低［17］，采样的差异也可能会使小部分材料出现假阴性。因此，采样时要尽量选取有明显症状的植株，从植株的不同方位（即东西南北中5个方位）均匀选取叶片进行检测，以减少假阴性的出现［6］。此次对湛江农垦红江橙主产区2个果园的普查发现，个别样本有典型的斑驳、黄化症状，但检测结果为阴性，是否与样本的采集有关有待进一步的证实。

通过对湛江农垦红江橙主产区2个果园具有黄化、斑驳等症状的红江橙叶片样本进行检测，确定这2个果园出现的黄化、斑驳等症状是由黄龙病的病原菌引起的。程保平等［6］通过对柑橘多个品种和多个部位中黄龙病菌的检测发现，失管果园是黄龙病传播的源头，黄龙病可能借助媒介昆虫-柑橘木虱传播到健康植株上。经调查可知，湛江农垦红江橙主产区这2个果园的水肥、除草等田间管理水平相差不大，不同之处在于红江农场38队果园周围有很多农户种植红江橙，且这些红江橙大多处于失管状态，杂草丛生，植株大都表现出黄化、斑驳等症状。黄龙病的平均检出率为53.1%，说明红江橙受黄龙病的危害较严重。广垦（湛江）农业科技有限公司横江果园周围只有少量的农户种植红江橙，黄龙病的平均检出率为48.6%，相对于红江农场38队果园来说发病率较低。这些现象说明果园周围失管可能会导致虫媒——柑橘木虱进入果园，危害该果园的红江橙。因此不仅要加强对果园的水肥、除草等田间管理，还要加强种苗的检测，以减少黄龙病对红江橙的危害。

综上所述，建议加强红江橙种苗黄龙病的检测检疫以及果园的栽培管理，及时挖除感病植株，同时可补种无病的红江橙大苗，预防柑橘木虱，坚持“预防为主、综合防治”的原则，采取防病与防虫相结合，化学药剂与生物防治相结合的方法，增施有机肥或特种肥，结合修剪控梢增强树势，减少木虱的数量，杜绝病害的持续蔓延。