婴幼儿配方粉中克罗诺杆菌检测方法研究进展

王倩宁 刘艳梅 王弋博 王廷璞

摘要：近克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是一种新发现的食源性致病菌，能引起婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎，致死率高.因此，建立准确、快速、有效的检测方法已成为克罗诺杆菌研究的首要任务.阐述了克罗诺杆菌的分类和检测研究进展，将传统生化检测、分子层面和免疫层面检测方法进行汇总对比，为进一步优化克罗诺杆菌的检测体系提供参考.

关键词：克罗诺杆菌;检测方法;研究进展

中图分类号：TS207.4  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）02-0036-07

食品安全是一個重大的全球性公共卫生问题，由致病菌引起的食源性疾病是当前最主要的食品安全问题.克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是新发现的一种食源性致病菌，分布广泛，在婴幼儿乳制品、鲜蔬菜、谷类、调味料及肉制品等多种食品中均被检出过[1]，该菌是一种条件性致病菌，致死率高达40-80%[2]，主要症状为婴幼儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等[3]，克罗诺杆菌被国际食品微生物标准化委员会列为“严重危害特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影响”的一种致病菌[4].目前还尚未确定克罗诺杆菌的宿主和传播途径，分析全球范围内报道的婴幼儿感染事件，表明婴幼儿配方粉是该菌的主要感染源[5].因此，建立快速有效的检测方法已成为克罗诺杆菌研究的主要内容之一.目前，国内外克罗诺杆菌的检测方法主要有常规生化检测方法、分子生物学检测法和免疫学为基础的检测方法.此文旨在从分类和检测方法两个方向来阐述克罗诺杆菌的研究进展，为研究克罗诺杆菌的有效检测方法提供更全面的参考.

1 克罗诺杆菌分类

克罗诺杆菌是一种寄生在人和动物肠道内，周身鞭毛、无芽孢的兼性厌氧型革兰氏阴性菌.初名黄色阴沟肠杆菌，直到1980年，Farmer等[6]人对肠杆菌进行DNA杂交试验，发现原黄色阴沟肠杆菌菌株之间DNA互补程度高达83-89%，与阴沟肠杆菌一致性仅为31-49%，结合生化反应、色素产物及抗生素敏感性等分析，Farmer等将其定义为肠杆菌属的一个新种，并建议更名为阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）.随着分子生物学技术的发展，Iverson等[7-8]根据16S rRNA基因序列特征、DNA杂交、核糖体分型以及扩增片段长度多态性荧光标记，对阪崎肠杆菌进行系统学分析，提议将该菌划分为一个新属——克罗诺杆菌属（Cronobacter gen. nov）.该属由1个新组合Cronobacter sakazakii;4个新种及l个基因种（Cronobacter genomospecies 1）组成.2012年Joseph等[9]对5株克罗诺杆菌的表型分型、7个管家基因的多位点序列进行分析和16S rRNA基因测序，发现了两个新种，尤尼沃斯克罗诺杆菌（Cronobacter universalis）和康帝蒙提克罗诺杆菌（Cronobacter condimenti），其中尤尼沃斯克罗诺杆菌代替之前的基因种.目前，克罗诺杆菌属包括7个种（见表1），和3个都柏林亚种（Cronobacter dublinensissubsp. Dublinensis），乳粉亚种（Cronobacter dublinensissubsp. Lactaridi）和洛桑亚种（Cronobacter dublinensissubsp. Lausannens）.

2 克罗诺杆菌的检测方法

2.1 传统生理生化检测方法

克罗诺杆菌的传统分离检测方法，首先进行富集培养，再进行选择性培养，经分离纯化后得到目标菌株，此方法依据菌株形态学特点和生化鉴定结果进行检测.

目前克罗诺杆菌主要的生理生化检测方法有3种：美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）方法、阪崎肠杆菌显色培养基（druggan-forsythe-iversen，DFI）方法和中国国家标准方法GB 4789.40-2016.

国际上首个官方检测方法是美国FDA在2002年制定的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离和计数”（此前名为阪崎肠杆菌）[10].检测时，在无菌条件下每个奶粉样品分别称取100g、10g和1g各3份，以1∶10稀释倍数进行稀释，取10mL混合液接种到90mL无菌肠杆菌增殖（enterobacteria enrichment broth，EE）肉汤中，37℃孵育过夜;后取适量增菌液划线于结晶紫中性红胆盐葡萄糖培养基（violet red bile glucose agre，VRBGA）上，37℃过夜培养.挑取5个典型或疑似菌落划线接种于大豆酪蛋白培养基（tryptose soya agar，TSA）上，25℃培养48-72h.用API 20E试剂条对TSA上的黄色菌落进行生化鉴定[11].该法需要7d左右的检测时间，且有些克罗诺杆菌与某些肠杆菌科菌株的菌落形态和颜色在VRBGA培养基上差异小，挑取难度较高，存在误检和漏检的风险.再者，有些克罗诺杆菌在TSA培养基上培养后菌体产生的黄色色素深浅不一，不易判定，也增加了误检和漏检的风险.

Guillaume-Genti等[12]将FDA方法中的EE肉汤更换为10mg/L改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose vancomycin medium，mLST-Vm）.随后的生理生化检测研究中在该法的基础上将选择性培养基VRBGA改进为阪崎肠杆菌显色培养基DFI，DFI培养基中加入了发色集团5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷（Xa-Glc），提高了检测的特异性.国际标准微生物委员会以此方法为检测婴幼儿配方粉的技术规范，即ISO/TS 22964-2006“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”[13].该方法用mLST-Vm和添加了显色剂Xa-Glc的DFI琼脂代替FDA方法中的EE肉汤和VRBGA，提高了阪崎肠杆菌的检出率[14-15].中华人民共和国国家标准GB 4789.40-2016“克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验”中，以mLST-Vm和阪崎肠杆菌显色培养基作为选择性增菌和选择性分离的培养基进行检测.

2.2 分子生物学检测法

常用的分子生物学检测方法有普通聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法、实时定量PCR法和环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）等.分子生物学检测方法解决了传统方法实验操作繁琐、检测时间长等问题.

2.2.1 普通PCR

2003年Keyser等[16]以阪崎肠杆菌16S rRNA -23S rRNA区域序列（ITS）为分子靶点，首次建立了阪崎腸杆菌的快速PCR检测方法.随后Lehner等[17]发现Keyser制定的PCR检测方法特异性不高，出现阴沟肠杆菌假阳性和莫金斯克罗诺杆菌假阴性的结果.针对这个问题，Lehner等研究克罗诺杆菌16S rRNA序列并建立进化树，形成了特异性强、高灵敏度的PCR检测系统，灵敏度高达10pg.

为了建立最适的阪崎肠杆菌PCR检测方法.Nair等[18]通过克隆阪崎肠杆菌的外膜蛋白A（ompA）基因，建立了单重PCR快速检测法，检测结果显示该方法对克罗诺杆菌的检测具有良好的特异性.楼秀芹等[19]针对克罗诺杆菌ompA基因、16s rDNA和ITS序列进行多重PCR检测，其结果与国家标准方法检测的结果相一致.Stoop等[20]首次提出针对克罗诺杆菌属特异性很强的rpoB基因序列设计引物进行检测.Huang等[21]通过克隆DNA促旋酶B亚基基因，构建了仅能区别阪崎克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌的PCR检测法.曲春波等[22]2013年首次利用编码DNA促旋酶B亚基基因（拓扑异构酶型Ⅱ）的gyrB看家基因，设计了特异性引物，灵敏度达到1.41 pg/PCR，建立了克罗诺杆菌PCR快速检测方法.可见普通PCR检测靶点包括16s rDN、ITS序列、ompA基因、rpoB基因和DNA促旋酶B亚基基因等.

2.2.2 实时定量PCR

实时定量PCR（又称荧光定量PCR），是一种核酸定量技术.在普通PCR检测基础上加入了荧光探针，把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，依据荧光检测信号的强弱来鉴定PCR产物，提高了检测的灵敏度[23].

2005年Seo和Brackett[24]首次针对阪崎肠杆菌dnaG基因5'端和rpsU基因3'末端设计引物和Taq Man探针，构建实时定量PCR检测方法.采用该体系鉴别克罗诺杆菌、肠杆菌和非肠杆菌科细菌，结果显示此方法特异性强、准确度高，检测灵敏度可达到0.6cfu/g.且检测过程中省去平板接种和生化鉴定的时间，检测效率远高于传统方法，作为FDA筛选和确认婴儿配方奶粉中克罗诺杆菌的官方方法之一.2012年Soler等[25]利用palF基因序列设计引物对多株克罗诺杆菌进行实时定量PCR检测，准确度达到100%，特异性强，未发现非克罗诺杆菌的菌株，且样品的检测限可达到1 cfu/10g，灵敏度高.Wang等[26]2012年利用MMS操纵子基因序列对67株菌株（包括4株克罗诺杆菌）进行实时定量PCR检测，检出率为100%，灵敏度高，且不受高浓度沙门氏菌侵染的影响.采用此方法和ISO方法同时对92份食品样品进行罗诺杆菌检测，其阳性检出率高于ISO方法.Dong等[27]和Hu等[28]分别针对ompA基因和cgcA基因设计探针引物，建立了比普通PCR灵敏度更高，特异性更强的检测方法.近年来，也有许多关于多重荧光定量PCR用于鉴定克罗诺杆菌的报到.Li等[29]以16S rRNA和fusA基因进行引物设计，建立出能够精确鉴别阪崎克罗诺杆菌和丙二酸盐阳性克罗诺杆菌的双重荧光定量PCR方法，检出限为102 cfu/mL.2016年Kaclíková和Oravcová利用dnaG基因建立了快速、准确地从婴幼儿配方奶粉产品中检测耐热性克罗诺杆菌的荧光定量PCR方法[30].

2.2.3 环介导恒温扩增技术

2000年Notomit等[31]建立了一种能在等温条件下，短时间内进行核酸扩增的环介导恒温扩增法.该技术能特异、高敏、高效地扩增目标基因，结果易判断.

贺楠等[32]基于克罗诺杆菌16S rRNA基因设计LAMP引物，最低检测限为0.3pg/DNA，灵敏度是普通PCR的1000倍.Liu等[33]和徐晓可等[34]探究了LAMP法和PCR法在克罗诺杆菌快速检测中的差异性，研究结果一致表明LAMP法检测的特异性和灵敏性明显优于PCR法.

马寅众等[35]对克罗诺杆菌16S rRNA基因及外膜蛋白A（ompA）基因设计LAMP引物进行LAMP法检测，ompA引物最低检出限仅为16S rRNA引物的1/10.即以外膜蛋白A（ompA）基因设计LAMP引物灵敏度更高.

李静等[36]在原有单引物环介导恒温扩增技术的基础上，以阪崎克罗诺杆菌ompA基因序列为靶序列，加入荧光染料，通过对荧光信号的分析，建立了一种操作简单、耗时短、可实时监控的实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌的方法.李丽丽等[37]针对克罗诺杆菌16S rRNA设计3组LAMP引物，建立的克罗诺杆菌恒温实时荧光检测法和传统国标检测结果一致，时效性高.

2.2.4 免疫学为基础的检测方法

免疫测定法（immunoassay，IA）是一种利用抗原和抗体特异性、可逆性为基础的诊断方法，对细菌的鉴别研究，已有多半个世纪[38].现已建立的克罗诺杆菌免疫学检测方法还不多.

2.2.4.1 免疫磁珠法（immunomagnetic separatio，MS）

免疫磁珠法是表面被抗体包被，进行抗原抗体特异性反应.在强大的外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细菌被滞留在磁场中，而其他没有该种表面抗原的细菌不能与免疫磁珠相结合，从而达到分离的目的.这一技术目前已经广泛运用于细胞分离、微生物检测、蛋白质组学等方面也多有应用.

朱英莲等[39]利用免疫磁性壳聚糖微球检测克罗诺杆菌，将氨基化修饰后的磁珠与克罗诺杆菌抗体进行偶联，捕获并富集细菌.结果显示该方法10.0min即可完成对克罗诺杆菌抗体的偶联，捕获率达94.7%，检测结果与传统培养法一致.说明免疫磁珠法是一种靶向特异性强、快速富集、分离克罗诺杆菌的有效方法.

Chen等[40]建立了一种免疫磁珠分离联合荧光定量聚合酶链反应（immunomagnetic separation polymerase chain reaction，IMS-PCR）快速检测克罗诺杆菌的方法，该法以免疫磁珠富集细菌，同时基于细菌外膜蛋白A（ompA）基因设计特异性引物，进行PCR检测，经过8h富集后，检出限从5.2×102cfu/mL降低至5.2×101cfu/mL.结果显示IMS-PCR方法非常灵敏、快速、可靠.支援等[41]使用量子点荧光标记和免疫磁性分离联合应用的检测方法，检测时间仅为2h，灵敏度高，特异性好，可应用于食品中的克罗杆菌检测.

2.2.4.2 脂质体免疫检测法（liposome immunoassay，LIA）

脂质体（Liposome）是脂类在水相介质中亲水头部插入水中，疏水尾部伸向空气，自发形成的内部中空外层是双层磷脂分子的球形小体[42]，直径约为25～1000nm.由于脂质体表面能结合单克隆抗体或基因抗体，内部水相可嵌合大量显色剂，使得所形成的免疫脂质体具有较高的灵敏度[43].

Song等[44]基于荧光脂质体结合免疫兔获得抗穆汀斯克罗诺杆菌Ig G，制备荧光标记免疫脂质体，捕获穆汀斯克罗诺杆菌，裂解后，在激发波长为550nm和发射波长585nm下测定荧光信号，结果显示此方法灵敏度为6.3×104cfu/mL，相比传统检测方法具有快速、高效、低成本的优点.2016年Shukla等[45-46]人建立的阪崎克罗诺杆菌脂质体免疫检测法灵敏度高于间接非竞争酶联免疫吸附，且与克罗诺杆菌其他菌属，以及其他非克罗诺杆菌无交叉反应.

2.2.4.3 酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）

酶联免疫吸附法同样以抗体和抗原的特异性结合为基础，和其他免疫方法区别在于其以酶或者辅酶标记抗原或者抗体，将抗原抗体的特异性与酶促反应的敏感性相结合，提高检测的灵敏性[47-48].采用ELISA技术，食品未经分离提取，即可进行定性和定量分析，显著提高了检出效率.目前，ELISA常用的方法有直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法等，该技术由于灵敏度高、特异性强、携带方便、易于商品化和经济实惠，在食品分析检测方面前景广阔.

宋春美等[49]和周鹤峰等[50]，建立双抗夹心法检测克罗诺杆菌，分别在6h和2h内得到检测结果，检出限均约在104cfu/mL，对其他食品中常见致病菌的检测均呈阴性，无交叉反应灵敏度高.

Park等[51]2012建立了一种可在24h内针对穆汀斯克罗诺杆菌的双抗夹心ELISA检测法，该法最低检出限为6.3×104cfu/mL，检测灵敏度高，与克罗诺杆菌其他菌属及其它常见致病菌间无交叉反应.Song等[52]利用间接非竞争性ELISA法建立了一种可同时检测7种克罗诺杆菌的快速检测方法，婴幼儿奶粉中含克罗诺杆菌细胞数在10个以下的样品，利用该方法可在36h内得到检测结果，显示出极高的灵敏性和特异性.

2.2.4.4 电化学免疫传感器（Electrochemical  Immunosensor）

电化学免疫传感器是将电化学传感与免疫分析技术相结合而构建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究，因其特异性高、快速、稳定性强、造价低且操作程序简易，在食品安全领域已有较多的研究和初步应用[53].

张晓等[54]依次将生物染料硫堇、辣根过氧化物酶标记的克罗诺阪崎肠杆菌抗体固定在用多壁碳纳米管/十二烷基苯磺酸钠修饰的四通道丝网印刷电极上，制成电化学免疫传感器.该方法检测阪崎克罗诺杆菌的线性范围为102-108cfu/mL，检出限为5.7×101cfu/mL，灵敏度很高，同时表现出较好的特异性和重现性（RSD=6.3%）.Shukla等[55]2018年使用氧化石墨烯纳米金离子复合物建立免疫传感器用于快速检测阪崎克罗诺杆菌.每个样品的分析时间只需要15min，无须任何富集或预富集，线性范围为2.0×102-2.0×107cfu/mL，检出限为2.0×101cfu/mL.与其他类型的克罗诺杆菌相比，此方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的选择性、再现性和反應性.表明其在阪崎克罗诺杆菌临床诊断中的具有潜在应用价值.

3 展望

克罗诺杆菌能引起新生儿致命伤害，而受到世界多国的高度关注，因此建立相关的有效检测方法极为重要.目前已逐步建立了克罗诺杆菌的传统生理生化检测、分子层面和免疫等层面的检测方法，其中传统生理生化检测不需要特殊的设备和技能，是食品安全国家标准选用的方法，也是各个质检部门的首选方法，缺点是耗时、费力;为适应食源性致病菌的快速检测，分子检测和免疫检测方法应运而生，分子检测方法灵敏度高、时效性好，且引物的扩增是在完全封闭状态下进行，避免了产物的污染，但分子层面的检测依赖基因的特异性，寻找特异性显著、可靠的基因片段，是以后的发展方向;抗体层面的检测基于抗原和抗体特异性结合，靶向特异性强、灵敏度高、简单、快速，成为近些年的研究热点.

综上所述，建立特异性好、敏感度高、简单经济、重现性高的克罗诺杆菌检测方法有待于进一步的研究.随着克罗诺杆菌属菌株基因数据库的完善，免疫传感器的性能的改善以及免疫检测手段的改进，分子层面、抗体层面及电化学相结合的检测方法将成为克罗诺杆菌检测的发展趋势.

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