基于染色体核型分析及单核苷酸多态性基因芯片技术的脐静脉血产前诊断分析▲

王立芳 龙喜贵

(1 广西壮族自治区妇产医院优生遗传门诊，南宁市 530003，电子邮箱：longlbbf@126.com； 2 广西壮族自治区人民医院医学遗传与产前诊断中心，南宁市 530021)

孕妇高龄或胎儿超声异常等高危因素是产前诊断的指征。对于产前诊断中胎儿染色体异常/畸变的检测，国内外均以常规细胞遗传学检测G显带核型分析及拷贝数变异(copy number variation，CNV)检测为主要方法。G显带核型分析可检测大于5 Mb的染色体异常[1]。相对于染色体核型分析，单核苷酸多态性微阵列基因芯片(single nucleotide polymorphism micro array，SNP-array)技术具有高通量、高分辨率等优势，美国妇产科医师学会已推荐其作为诊断评估胎儿染色体结构异常的一线检测方法[2]。本研究通过联合应用需细胞培养的染色体核型分析及不需细胞培养的SNP-array技术，对高危孕妇脐静脉血进行染色体异常的产前诊断，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月至2019年7月在广西壮族自治区妇幼保健院行产前筛查及遗传咨询时发现有产前诊断指征的4 843例孕妇，年龄18～43岁，入组时孕周25～32周。纳入标准：(1)孕周≥25周；(2)符合脐静脉血产前诊断的指征，即产前筛查高风险(包括临界风险)、高龄、胎儿B超指标异常(包括水肿、单脐动脉、心室强光斑、肠管回声增强、肾盂扩张、脑室扩张、脉络丛囊肿、鼻骨缺如、长骨短小等)、不良生育史、辅助生殖术后等。排除标准：(1)有急性感染；(2)有先兆流产倾向；(3)不符合产前诊断指征等。

1.2 检测方法 侵入性产前诊断取材、检测方法均遵守广西壮族自治区妇幼保健院医学伦理学委员会的要求，所有孕妇术前常规进行咨询并签署知情同意书，结果出具后复诊及咨询。B超引导下抽取胎儿脐静脉血2～3 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管送实验室行染色体核型分析及SNP-array检测。

1.2.1 染色体核型分析：取0.5 mL脐静脉血接种于5 mL GIBCO淋巴细胞培养基，于37℃、5%二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)中培养72 h，加入40 μg/mL秋水仙素(广州达晖生物技术股份有限公司)20 μL，继续培养3 h后进行收获，滴片及G显带(Giemsa染色)，应用MetaSystems染色体自动扫描分析系统(德国ZEISS公司)进行核型分析，每例标本核型计数20个中期分裂相，分析不少于5个核型，如发现异常则加倍计数和分析，必要时做C、N带分析。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)标准进行核型分析诊断。

1.2.2 SNP-array技术：经知情同意谈话告知患者该检测的必要性，最终共2 986例患者自愿进行检测。取2 mL脐静脉血，提取DNA，DNA提取试剂盒(批号：5ak022)及Lab-Aid820核酸提取仪由厦门致善生物科技有限公司提供。获得DNA后行基因芯片检测，选用HumanCyto SNP-12 BeadChip Kits芯片及配套试剂盒(美国Illumina公司，批号：WG-320-2101)，按试剂盒操作说明进行芯片制备、扫描(美国Illumina iScan芯片扫描仪)。查阅文献及ClinVar(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、DECIPHER(https://decipher.sanger.ac.uk/)、UCSC(http://genome.ucsc.edu/)、OMIM(http://www.omim.org/)、DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)等数据库，分析CNV的致病性。

1.2.3 联合检测结果的判断：在2 986例同时接受两种方法检查的病例中，任意一种检测发现异常，即判断为联合检测异常。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4 843例脐静脉血标本总染色体核型分析结果 4 843例脐静脉血标本中，共发现染色体核型异常288例(5.95%)，其中常染色体三体最为常见，见表1。此外，还检出染色体多态138例(2.85%)，包括49例(1.01%)1qh+、39例(0.81%)inv(9)(p12q13)、11例(0.23%)9qh+、14例(0.29%)16qh+、7例(0.14%)inv(Y)(p11q11)、7例(0.14%)21pstk+等。

表1 4 843例胎儿脐静血标本的染色体核型异常表现

2.2 同时行两种检查的2 986例脐静脉血标本的检测结果 要求同时行SNP-array检测的2 986例标本中，染色体核型分析提示核型正常、异常、染色体多态各2 714例(90.89%)、203例(6.80%)、69例(2.31%)。

2 986例脐静脉血标本中，SNP-array技术共检出262例(8.77%)胎儿存在致病性CNV。在2 714例染色体核型正常的胎儿中，经SNP-array检测发现106例(3.91%)存在致病性CNV；在203例染色体核型异常的胎儿中，经SNP-array检测发现152例(74.88%)存在致病性CNV，其余51例(25.12%)为无明确CNV变化；在69例染色体多态的胎儿中，经SNP-array检测发现4例(5.80%)致病性CNV。此外，SNP-array共检出156例(5.22%)临床意义不明确变异。从2 568例SNP-array检测正常及156例SNP-array检测为临床意义不明确变异的标本中分别检测46例(22.66%)、5例(2.46%)染色体核型异常。见表2。

表2 2 986例胎儿脐静脉血标本的SNP-array检测结果[ n(%)]

2.3 染色体核型分析 染色体核型分析与SNP-array技术联合检测的异常检出率为10.48%(313/2 986)。染色体核型分析、SNP-array技术及两者联合检测的异常检出率比较，差异有统计学意义(χ2=25.593，P<0.001)。联合检测的异常检出率与单独染色体核型分析异常检出率(6.80%)、单独SNP-array技术的异常检出率(8.77%)相比，分别提高了3.68%及1.71%(均P<0.05)。

3 讨 论

孕晚期脐静脉血取材产前诊断是预防出生缺陷的重要举措。染色体核型分析及全基因组CNV检测是产前诊断中染色体病与基因组病的确诊方法。传统的细胞遗传学技术染色体核型分析，能够检测染色体易位、倒位等平衡变异。而染色体微阵列分析可以检测染色体核型分析技术不能检测出的微小缺失或重复等，两者联合检测可提高产前诊断的诊断率。

本研究对存在产前诊断指征的4 843份脐静脉血标本进行产前诊断，共检出异常核型288例(5.95%)，高于吴汉锋等[3]报告的结果(3.87%)，这可能与地域差异，以及部分病例为羊水检测已为异常需进一步脐静脉血标本复核等有关。性染色体单体/三体的发病机制通常与配子发生减数分裂时性染色体不分离或早期胚胎细胞有丝分裂中的性染色体不分离有关[4-5]。本研究结果显示，在288例异常的核型中，共检出29例(10.07%)性染色体单体/三体，检出率较高，原因可能是性染色体的单体或三体为非致死性，从而使胎儿能存活至产前诊断或出生。21-三体、18-三体、13-三体是导致出生缺陷的常见原因。本研究中，常染色体三体是最为常见的染色体核型异常，包括104例(2.15%)21-三体、36例(0.74%)18-三体、9例(0.19%)13-三体，以21-三体最多见，与其他研究[6]结果相近。而这3种常见的三体综合征是胎儿致愚、致残、致死的常见原因，因此，针对常见三体综合征的产前诊断工作依然是重点。目前，随着无创产前检测等技术的发展，在早孕期及中孕期，这三种类型的三体综合征大多能够被检出，真正需要拖延到孕晚期行脐静脉血产前诊断的情况逐渐减少，但对于未行筛查或绒毛、羊水产前诊断的孕妇，脐静脉血诊断是对前期漏检的一种有力补救手段。此外，在本研究中，脐静脉血染色体核型检测还检出49例1qh+、39例inv(9)(p12q13)及14例16qh+等正常染色体多态性变异，其主要涉及随体及异染色质区，一般位于1、9、16和Y染色体异染色质区和染色体着丝粒区。通常染色体多态性不会导致相关的病理表型或不良事件。但也有研究表明，染色体的多态性可能与不良生育有关[7]，这可能是因为单纯的染色体多态未能完全排除基因组CNV。本研究中，共有69例染色体多态核型的标本进一步行SNP-array分析，最终检出4例致病性CNV，因此，染色体核型检测提示“染色体多态”时尚需排除致病性CNV的情况，以更全面地给予遗传咨询及判断胎儿预后。

对胎儿细胞提取DNA进行CNV检测，是近年来随着二代测序技术发展而逐步被开发利用于产前诊断的遗传学检查方法。在超声检查发现胎儿畸形的情况下，行CNV检测可提高致病性CNV或临床意义不明确变异的检出水平[2]。染色体微阵列分析相当于检测常见非整倍体的核型分析[8]。有学者认为，年龄小于36岁的孕妇，其胎儿发生致病性CNV的风险高于唐氏综合症[9]。这说明不管高龄与否，常规开展CNV检测具有必要性。本研究结果显示，在2 714份染色体检测正常的脐血标本中，致病性CNV检出率为3.91%；与单独染色体核型分析及单独SNP-array检测相比，二者联合应用的异常检出率分别提高了3.68%及1.71%(均P<0.05)，与其他研究[10]报告的结果类似。这说明二者联合应用在一定程度上提高了异常检出率，可为遗传咨询及产前诊断提供更多的依据。但检测前需进行遗传咨询，从而使患者充分了解SNP-array检测技术的益处及局限性，并根据他们的实际情况做出是否进行检测的决策[11-12]。

此外，同时接受染色体核型分析及SNP-array检测的2 986例标本中，有156例脐静脉血标本检测存在临床意义不明确变异。这些临床意义不明确变异由于变异与表型之间的相关性或证据不足，无法关联胎儿表型[13]，这给临床诊断及遗传咨询带来了不小压力；而仅在某些情况下，从具有已知染色体疾病表型或没有明显表型的亲本中，鉴定出等效临床意义的不明确变异才可辅助其诊断[14]。随着CNV检测技术的发展及广泛应用，数据库及资料逐渐完善，这种情况或许将得到改善。对于新发现的临床意义不明确变异，美国妇产科医师学会建议对患儿出生后进行随访[15]。

尽管相对于常规核型分析，基因芯片技术具有分辨率及灵敏度更高等特点，但无法检出染色体核型牵涉到无遗传物质改变的衍生染色体、标记染色体、易位、倒位及芯片探针未覆盖的区域等。本研究中，从2 568例SNP-array检测正常及156例SNP-array检测为临床意义不明确变异的标本中，分别检测出46例(22.66%)、5例(2.46%)异常染色体核型，这表明尽管核型分析耗时、费力且分辨率有限，但仍然在产前诊断和遗传咨询中的遗传染色体重排中发挥关键作用[16]。此外，联合超声检查、无创产前检测等的结果，充分考虑不同检测方法的局限性，告知各种诊断方法及策略的利弊后，做好检测前咨询，由孕妇及家属知情选择也是十分必要的[17]。

综上所述，及时、有效地进行遗传咨询，并结合具体情况在孕期提供产前诊断：联合B超、染色体核型分析及基因芯片检测等多种技术能提高出生缺陷患儿的检出率，改善产前诊断的诊断性，有利于优生优育。但随着技术发展，关于对无遗传物质改变的衍生染色体、标记染色体、易位、倒位是否需进行产前诊断，以及是否CNV检测技术能完全取代G显带核型分析，尚需进一步讨论。