急性冠脉综合征患者血浆微小RNA-130a表达水平及其临床意义▲

余 明 陈 涛 张 欢 徐 林 夏 豪

(武汉大学人民医院心内科，心血管病湖北省重点实验室，武汉市 430060，电子邮箱：691027408qq@qq.com)

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)最常见的类型包括ST段抬高型心肌梗死、非ST段抬高型心肌梗死和不稳定型心绞痛(unstable angian，UA)[1]。世界卫生组织推荐门-球时间不应大于90min[2]，因此及时的诊治对于ACS患者至关重要。近年来心肌梗死患者的危险分层一直是研究的热点，尽管目前临床上普遍把肌钙蛋白作为诊断心肌梗死的一项高特异性和高敏感性的标志物，但越来越多的危险分层因子被证明可在ACS患者的临床诊断、治疗及预后中提供重要依据。微小RNA (microRNA，miRNA)是一类长度为18～25个核苷酸的内源性保守型小非编码核糖体RNA，在血浆、血清和尿液中都能检测到，并在人体内环境中保持非常稳定的状态，其通过调控靶基因的转录在大多数真核细胞的增殖、分化、生长和凋亡过程中，都发挥着基因表达调节剂的作用[3]。研究显示，在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)动物模型和ST段抬高型心肌梗死患者血浆中，一些心脏相关miRNA如miRNA-1、miRNA-133a和miRNA-499，其血浆水平显著升高[4]，部分与ACS相关的miRNA也被证实与目前临床上公认的特异性心肌梗死坏死标志物心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)密切相关[5]。随着心血管病机制研究的不断更新以及基因技术日趋成熟，miRNA作为心血管疾病诊治的新型生物标志物也逐渐被学者们关注。近年来，在ACS动物模型实验中miRNA-130a被证实参与心肌梗死的发生发展[6-7]。故本研究探讨miRNA-130a在ACS患者血浆中的表达情况及临床意义。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2017年9月至2018年6月武汉大学人民医院心内科收治的101例ACS患者，包含AMI患者54例(AMI组)及UA患者47例(UA组)。纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)临床症状符合ACS，如典型胸痛或突然发作的呼吸困难；(3)入院心电图提示至少2条相邻的前区导联ST段抬高0.2 mV，或至少2条相邻的肢体导联ST段抬高0.1 mV，或出现新的左束支传导阻滞；(4)入院1 h内未经治疗，心肌酶学提示ACS。排除标准：(1)肝肾等器官功能障碍、慢性疾病、神经运动系统疾病、严重心律失常、心源性休克的患者；(2)未经治疗死亡以及发病时间不详的患者，或发病12 h内未采集血样的患者。同时选取于该院健康体检的20例健康者作为对照组，心肌酶学、心脏彩超、冠脉造影均正常，且排除其他脏器严重疾病。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有研究对象或其家属均对本研究内容知情同意。

1.2 样本的收集 ACS患者和对照组分别在入院24 h内、体检当日使用乙二胺四乙酸二钾抗凝管采集静脉血5 mL，置于4℃低温冰箱静置30 min后以3 000 r/min离心10 min，收集上层血清于无菌无RNA酶EP管中，存储于-80℃冰箱中备用检测。

1.3 miRNA-130a的检测方法 取200 μL上述血浆样本于1 000 μL无菌无RNA酶EP管中，加裂解液充分混匀裂解，应用 Tripure Total RNA Extraction Reagent试剂盒(ELK Biotechnology公司，批号：EP013)提取血清总RNA，提取的RNA用分光光度计测浓度及纯度，保证RNA溶液的A260/A280比值在1.8～2.1之间，RNA纯度高、无降解、无DNA 污染即可用于cDNA合成。第一链cDNA的合成采用M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒(ELK Biotechnology公司，批号：EQ002)，选用U6作为内参基因。U6正向引物 5′-3′CTCGCTTCGGCAGCACA，反向引物5′-3′AACGCTTCACGAATTTGCGT；miRNA-130a引物序列正向引物 5′-3′CTCGCTTCGGCAGCACAT，反向引物5′-3′AACGCTTCACGAATTTGCGT。引物均由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。按试剂盒说明书进行反转录。反转录反应总体积为15 μL，包括7 μL预混液，3 μL引物和5 μL样本RNA；反应条件为16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃15 min。在Life Technologies公司的StepOnePlusTMReal-Time PCR仪上完成实时荧光定量PCR，每个样品均设3个复孔，使用EnTurboTMSYBR Green PCR SuperMix试剂盒(ELK Biotechnology公司，批号：EQ001)，按照说明书进行操作，反应体系包括2×Master Mix 5.0 μL，2.5 μM引物工作液1.0 μL，CDNA模板 1.0 μL，ddH2O 2.0 μL，Rox 1.0 μL。反应程序为PCR仪上预变95℃，30 s，循环40次(95℃，5s→58℃，30s→72℃)。扩增反应结束后，获得产物扩增曲线、融解曲线及CT 值，通过z-△△CT法计算miRNA-130a的相对表达量。

1.4 收集临床资料 收集入院24 h内ACS患者的心脏彩超指标、冠状动脉造影指标及生化指标，包括超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)、肌酸激酶同工酶(creatinine kinase MB isoenzyme，CK-MB)、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、N-末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、Gensini评分、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、总胆固醇、三酰甘油、尿酸、纤维蛋白原、HDL等。并收集对照组心肌酶指标。

1.5 冠状动脉Gensini评分 所有ACS患者于住院期间行冠状动脉造影检查，结果由2～3名心内科专业副高级及以上医生确定及审核。常规左侧冠状动脉投射6个体位，右侧冠状动脉投射2个体位，并根据个体病情适当增加投射体位。以各个投射体位中狭窄最严重程度作为病变狭窄程度。依据冠状动脉直径狭窄≥50%累及左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉的支数分为单支病变、双支病变(累及左主干为双支病变)及三支病变。采用Gensini积分系统对每支冠状动脉病变狭窄程度进行定量评分，每处病变的积分为狭窄程度的评分乘以相应病变部位的系数。狭窄程度评分：直径狭窄<25%计1分，25%≤直径狭窄<50%计2分，50%≤直径狭窄<75%计4分，75%≤直径狭窄<90%计8分，90 %≤直径狭窄<99%计16分，直径狭窄≥99%计32分。不同冠状动脉分支相应系数：左主干病变×5；左前降支病变近端×2.5，中段×1.5；对角支病变第一对角支×1，第二对角支×0.5；左回旋支病变近端×2.5，远端×1；后降支×1；后侧支×0.5；右冠状动脉病变近、中、远和后降支均×1。各病变支得分总和即为患者的冠状动脉病变狭窄程度总积分。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t法；非正态分布计量资料以[M(QR)]表示，比较采用非参数检验。计数资料以例数或百分比表示，比较采用χ2检验。采用Pearson相关系数进行相关性分析。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线评估miRNA-130a对AMI及UA的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组研究对象的一般资料及检测指标比较 3组的性别、年龄比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。对照组、UA组、AMI组miRNA-130a相对表达量、CK-MB、肌红蛋白、cTnI均依次升高(P<0.05)，见表1。

表1 3组研究对象临床资料的比较

注：与AMI组比较，#P<0.05；与UA组比较，*P<0.05。

2.2 ACS患者临床指标与miRNA-130a表达量的相关性 ACS患者的miRNA-130a相对表达量与HDL、LVEF均呈负相关(r=-0.325、-0.437，均P<0.001)，与CK-MB、肌红蛋白、cTnI、 NT-proBNT、Gensini评分、总胆固醇、三酰甘油、hs-CRP、尿酸、纤维蛋白原均呈正相关(r=0.486、0.445、0.566、0.399、0.535、0.485、0.326、0.285、0.436、0.215，均P<0.001)。

2.3 miRNA-130a、cTnI、CK-MB、Gensini评分对UA及AMI的诊断价值 RCO曲线分析结果显示，血浆miRNA-130a、cTnI、CK-MB水平及Gensini评分在诊断UA的曲线下面积分别为0.982、0.352、0.650、0.955。血浆miRNA-130a、cTnI、CK-MB、Gensini评分诊断AMI的曲线下面积分别为1.000、0.948、0.859、0.991。见表2～3，图1～2。

表2 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini评分对UA的诊断价值

表3 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini评分对AMI的诊断价值

图1 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini评分诊断UA的ROC曲线 图2 miRNA-130a、cTnI、CK-MB及Gensini评分诊断AMI的ROC曲线

3 讨 论

ACS是以冠状动脉内斑块不稳定为主要病理特征，临床表现为心肌缺血的一类综合征，包括UA、非ST段抬高心肌梗死和ST段抬高心肌梗死，在临床工作中不易鉴别[8-9]。如果有一种更灵敏、更具特异性的生物标志物能够用于区分ACS类型，同时能够鉴别心源性疾病以外的疾病(如纵隔疾病、反流性食管炎)，将大大提高ACS的诊断正确率。miRNA在心脏发育、细胞增殖、凋亡及肿瘤发生中起到重要的调控作用[10]。目前，在用于ACS诊断和评估预后的各种循环miRNA中，最具研究价值的是miRNA-1-3p[11]、miRNA-133a-3p和miRNA-133b[12]，以及对心脏具有特异性的miRNA-499a-5p[13]。研究显示，血浆中miRNA表达水平与目前国际公认的心肌坏死特异性标志物cTnI有相同的时间演变进程[14]。

Chen等[15]建立缺血缺氧诱导的心肌细胞损伤动物模型，发现缺氧心肌细胞中miRNA-130a的表达显著增加，且其表达量与心肌细胞损伤程度呈正比，反之抑制miRNA-130a的表达则可以显著减轻心肌细胞损伤；其并采用人长链非编码RNA芯片V3.0进行基因差异分析，也发现miRNA-130a在心肌梗死后心肌细胞中过表达。本研究结果显示，对照组、UA组、AMI组的血浆 miRNA-130a相对表达量依次升高(P<0.05)，提示在ACS患者中miRNA-130a表达上调，同时其或可用于鉴别AMI及UA。 cTnI、CK-MB、肌红蛋白是目前全世界公认的诊断急性心肌梗死的特异性心肌标志物[16]。本研究中，UA组、AMI组cTnI、CK-MB、肌红蛋白水平均高于对照组(均P<0.05)，提示ACS患者血浆中miRNA-130a表达量与以上心肌坏死标志物水平变化趋势有良好的一致性。Pearson相关分析显示，ACS患者的miRNA-130a相对表达量与CK-MB和cTnI水平、Gensini评分均呈正相关(均P<0.05)，提示将血浆miRNA-130a相对表达量与CK-MB、cTnI、冠脉Gensini评分相结合，或可在诊断ACS、判断冠脉狭窄程度方面为临床医生提供重要参考依据。此外，本研究中miRNA-130a也与ACS发病危险因素如NT-proBNP、总胆固醇、尿酸、HDL等[17]具有相关性(P<0.05)。其中NT-proBNP由心室心肌合成和分泌，其在ACS患者中的表达明显升高[18]，是ACS的重要诊断标记物和短期死亡率的重要独立预测因子。

ROC曲线结果显示，miRNA-130a表达量诊断AMI的曲线下面积达1.000，诊断灵敏度与Gensini评分相近，提示其对AMI具有非常高的诊断效能；其诊断AMI的灵敏度优于心肌梗死特异性指标cTnI，但特异度较cTnI差，这提示在临床工作中如综合评估二者的检测结果，能提高对AMI诊断的准确性和及时性。此外，miRNA-130a表达量诊断AMI的曲线下面积达0.982，具有较高的诊断效能；其曲线下面积、敏感性和特异性均与Gensini评分相似，且均优于 cTnI、CK-MB。在临床工作中，有部分高龄UA患者症状比较隐匿，且对冠脉造影检查手术耐受能力较差，因此如果能结合血浆 miRNA-130a表达量，或可提高这部分患者的诊断阳性率，从而使临床医生采取更积极有效的治疗方案。

综上所述，UA和AMI患者血浆miRNA-130a表达水平上调，并有可能为临床工作中鉴别ACS分型提供重要依据。血浆miRNA-130a水平对AMI及UA均有较高的诊断效能，其与目前公认的心肌梗死特异性标志物联合应用，有望提高ACS的诊断特异性、敏感性及时效性。