健脾补肾方对再生障碍性贫血患者免疫T细胞亚群及相关细胞因子的影响

曹宇峰 张琳琳 吕丽丽 王磊 边月平

再生障碍性贫血(AA)是由于理化因素、遗传因素、病毒感染等多种因素引起造血干细胞质/量异常，从而导致骨髓增生极度减低和全血细胞减少的一种血液系统难治性疾病[1-3]。目前认为，AA发生发展与T细胞免疫功能异常、造血微环境调节紊乱及细胞因子分泌失调等因素导致骨髓免疫损伤有关[4-6]。本课题组采用健脾补肾方治疗AA，以AA患者外周血免疫T细胞、血清细胞因子及外周血单个核细胞(PBMCs)转录因子表达为指标，进一步深入研究健脾补肾方发挥治疗作用的免疫学机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年1月至2018年6月我院收治的AA患者90例，按照随机数字表法随机分为对照组和治疗组，每组45例。对照组男25例，女20例；年龄32～61岁，平均(39.12±5.42)岁；病程1～12年，平均(5.12±0.73)年；中医证候分型：脾肾阴虚型10例，脾肾阳虚型19例，脾肾阴阳两虚型16例；治疗组男23例，女22例；年龄30～65岁，平均(40.00±5.51)岁；病程1～14年，平均(5.78±0.82)年；中医证候分型：脾肾阴虚型12例，脾肾阳虚型18例，脾肾阴阳两虚型15例。2组年龄、性别比、病程、中医证候分型等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较 n=45

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：(1)符合《血液病诊断及疗效标准》制定的再生障碍性贫血诊断标准，且经临床症状体征、血常规指标、骨髓涂片及病理学检查确诊为AA；(2)符合《中药新药临床研究指导原则》制定的中医辨证分型诊断标准；(3)入组前2周内未接受过激素、化疗药物治疗者；(4)患者均自愿参加本研究，且签署知情同意书。排除标准：(1)合并PNH、白血病等其他血液系统疾病；(2)合并心、肝、肺、肾等重要脏器功能不全者；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)对本研究药物过敏或有禁忌症者。

1.3 治疗方法 对照组给予环孢素A治疗，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同时根据病情给予抗感染、补血及止血药物。治疗组给予健脾补肾方治疗，组成：黄芪 24 g，女贞子 15g，太子参 24 g，白术芍 15 g，炒丹皮 15 g，制半夏 10g，小蓟草 15 g，菟丝子 24 g，炒枳壳 10 g，炙甘草 6 g。1个月为1个疗程，共治疗2个疗程。针对不同中医辨证分型，健脾补肾方中分别配伍不同中药，脾肾阴虚型可选择滋阴生精的药物，如生地黄、黄柏等；脾肾阳虚型可选择填精助阳的药物，如补骨脂、淫羊藿；脾肾阴阳两虚型可选择阴阳双补的药物，如杜仲、制首乌等。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 外周血免疫T细胞:分别于治疗前后抽取患者外周血5 ml，采用流式细胞仪测定免疫T细胞比例，包括Th、Tc、NK、Th17、Treg细胞，计算Th/Tc、Th1/Th、Th17/Treg比值。

1.4.2 PBMCs转录因子表达:采用Real time-PCR法测定PBMCs T-bet、GATA-3、RORγ、Foxp3 mRNA表达。按照TRizol说明书进行骨髓基质细胞总RNA的提取和逆转录，SYBR Green染料法进行目的基因扩增，根据RQ=2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。见表2。

1.4.3 血清细胞因子:分别于治疗前后抽取患者外周血5 ml，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定TGF-β1、IFN-γ、TNF-α水平。

表2 Real time-PCR引物序列

2 结果

2.1 2组外周血淋巴细胞亚群比较 治疗前2组外周血Th、Tc、NK细胞比例及Th/Tc比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后2组外周血Th、NK细胞比例及Th/Tc均明显高于治疗前，Tc细胞比例均明显低于治疗前，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且治疗组Th、NK细胞比例及Th/Tc高于对照组，Tc细胞比例低于对照组(P<0.05)。见表3。

2.2 2组外周血Th1、Th2细胞比较 治疗前2组外周血Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后2组外周血Th1细胞比例及Th1/Th2均明显低于治疗前，Th2细胞比例均明显高于治疗前，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且治疗组Th1细胞比例及Th1/Th2低于对照组，Th2细胞比例高于对照组(P<0.05)。见表4。

2.3 2组外周血Th17、Treg细胞比较 治疗前2组外周血Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后2组外周血Th17细胞比例及Th17/Treg均明显低于治疗前，Treg细胞比例均明显高于治疗前，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且治疗组Th17细胞比例及Th17/Treg低于对照组，Treg细胞比例高于对照组(P<0.05)。见表5。

组别Th(%)Tc(%)Th/TcNK(%)对照组 治疗前26.87±4.2541.34±6.230.68±0.129.53±1.24 治疗后31.29±4.62∗37.00±5.48∗0.85±0.14∗12.89±1.67∗治疗组 治疗前27.20±4.3140.85±6.180.70±0.139.56±1.29 治疗后35.99±5.11∗#32.32±4.86∗#1.13±0.17∗#15.90±2.16∗#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

组别Th1(%)Th2(%)Th1/Th2对照组 治疗前0.53±0.080.32±0.041.62±0.23 治疗后0.44±0.06∗0.50±0.07∗0.89±0.11∗治疗组 治疗前0.55±0.090.30±0.051.60±0.25 治疗后0.31±0.04∗#0.78±0.11∗#0.42±0.06∗#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

组别Th17(%)Treg(%)Th17/Treg对照组 治疗前1.23±0.183.11±0.420.43±0.05 治疗后0.76±0.11∗3.98±0.48∗0.22±0.03∗治疗组 治疗前1.20±0.163.08±0.400.41±0.06 治疗后0.39±0.06∗#4.84±0.53∗#0.10±0.02∗#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

2.4 2组血清细胞因子水平比较 治疗前2组血清TGF-β1、IFN-γ、TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后2组血清TGF-β1水平均明显高于治疗前，IFN-γ、TNF-α水平均明显低于治疗前，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且治疗组TGF-β1水平高于对照组，IFN-γ、TNF-α水平低于治疗组(P<0.05)。见表6,图1。

2.5 2组PBMCs转录因子表达比较 治疗前2组PBMCs T-bet、GATA-3、RORγ、Foxp3 mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后2组PBMCs T-bet、RORγ mRNA表达均明显低于治疗前，GATA-3、Foxp3 mRNA表达均明显高于治疗前，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且治疗组T-bet、RORγ mRNA表达低于对照组，GATA-3、Foxp3 mRNA表达高于治疗组(P<0.05)。见表7,图2。

组别TGF-β1IFN-γTNF-α对照组 治疗前74.32±10.1480.44±10.89285.76±24.56 治疗后118.65±12.54∗58.32±8.56∗199.54±15.87∗治疗组 治疗前73.68±9.7982.05±12.43292.65±28.55 治疗后150.23±14.52∗#33.42±4.10∗#86.76±11.43∗#

注：与治疗前比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05

图1 ELISA测定细胞因子水平

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

组别T-bet mRNAGATA-3 mRNARORγ mRNAFoxp3 mRNA对照组 治疗前0.98±0.130.31±0.041.24±0.200.40±0.06 治疗后0.69±0.08∗0.52±0.07∗0.79±0.13∗0.65±0.08∗治疗组 治疗前1.02±0.160.33±0.051.21±0.170.41±0.05 治疗后0.42±0.05∗#0.89±0.12∗#0.30±0.05∗#0.98±0.14∗#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

3 讨论

图2 Real time-PCR法测定转录因子表达

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

研究表明，骨髓微环境中的多种因素能够调控T细胞亚群的增殖、分化过程。其中转录因子在调控T细胞亚群定向分化中的作用尤为重要。T-bet、GATA-3分别是Th1、Th2特异性转录因子，二者间具有相互调节和抑制作用，T-bet/GATA-3是反映Th细胞失衡的敏感性指标。而RORγ是Th17细胞特异性转录因子，具有促进Th17细胞分化并抑制Treg细胞分化的作用。Foxp3是Treg细胞特征性的分子标志物，具有调节Treg细胞发育、分化及免疫耐受等作用[15,16]。Du等[17,18]研究显示，AA患者PBMCs中T-bet、RORγ mRNA表达较正常人显著升高，GATA-3、Foxp3 mRNA表达较正常人显著降低，提示AA患者存在Th1/Th2、Th17/Treg失衡，此时Th1、Th17型免疫应答占优势及T细胞活化增加，从而抑制造血干/祖细胞增殖并促进其凋亡，最终导致骨髓造血功能衰竭。因此，检测T-bet、RORγ、GATA-3、Foxp3表达能够反映Th1/Th2、Th17/Treg及细胞免疫功能状态。本研究采用Real time-PCR检测了PBMCs中T-bet、RORγ、GATA-3、Foxp3 mRNA表达，结果表明，治疗后2组PBMCs中GATA-3、Foxp3 mRNA表达均明显高于治疗前，PBMCs中T-bet、RORγ mRNA表达均明显低于治疗前，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，且治疗组以上指标改善程度优于对照组(P<0.05)。说明健脾补肾方可能通过下调T-bet、RORγ表达，上调GATA-3、Foxp3表达调控T细胞的增殖、分化，纠正细胞免疫功能紊乱，并促进造血功能恢复。

综上所述，健脾补肾方治疗再生障碍性贫血疗效显著，能够有效调节T细胞免疫功能，其机制与纠正Th细胞亚群失衡，调节相关转录因子、细胞因子分泌，从而减轻T细胞免疫亢进对骨髓造血的抑制作用。然而，由于Th细胞与转录因子、细胞因子间存在相互作用，健脾补肾方作用的具体靶点尚需进一步研究。