KIF11、RhoA和Fascin蛋白在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

余 璐 文 燕 汤俊起

口腔鳞状细胞癌是存在于口腔黏膜上皮的鳞状细胞癌，它能早期经淋巴结转移至其他组织器官，有烟酒嗜好的中年人群多发[1]。口腔鳞癌的预后较差，一般采用手术切除作为常用的治疗手段，但是手术的问题在于严重影响患者的面部美观[2-3]。驱动蛋白(kinesin)在膜性细胞器的运输，有丝分裂、信号转导、mRNA和蛋白质的运输等方面起着重要作用[4-5]。驱动蛋白家族成员KIF11作用于早期的有丝分裂，在染色体的分离起着很重要的作用，和细胞增殖有相关性[6]。RhoA属于小G蛋白的Ras超家族成员，广泛参与肌动蛋白的细胞骨架重组、细胞黏附、细胞运动等涉及肿瘤侵袭和转移的各个环节的调控[7]。Fascin蛋白是肌动蛋白结合蛋白，对细胞移动起着重要作用。研究发现Fascin蛋白在多种肿瘤组织和癌前病变组织中呈现上调表达。有研究显示Fascin蛋白对肿瘤早期诊断、预后判定、辅助治疗选择具有重要意义[8-9]。

本研究通过检测KIF11、RhoA和Fascin蛋白在口腔鳞癌中的表达及与口腔鳞癌临床病理特征的关系，为口腔鳞癌的预后判断及临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年2月至2018年2月我院保存的口腔鳞癌蜡块组织标本70例，其中，男性40例，女性30例；年龄40～73岁，中位年龄61岁。淋巴结转移患者29例，无淋巴结转移患者41例；病理分级参照WHO口腔鳞癌分级标准，高分化32例，中分化28例，低分化10例；TNM分期标准，T1期11例，T2期24例，T3期20例，T4例15例。患者纳入标准：①病理确诊为口腔鳞癌；②在手术前没有接受过放疗和化疗等；③临床资料相对完整。排除合并其他原发性恶性肿瘤的患者。选取相同组织标本距癌组织>2 cm的癌旁组织作为对照，经病理性确认切缘为阴性。

1.2 主要试剂

Trizol试剂(北京百泰克生物技术有限公司)；甲紫溶液(广东恒健制药有限公司)；无酶的RNA冲洗液(北京百泰克生物技术有限公司)；免疫荧光制剂(北京百泰克生物技术有限公司)。鼠抗人KIF11单克隆抗体、鼠抗人RhoA单克隆抗体和鼠抗人Fascin单克隆抗体(美国Abcam公司)；生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.3 免疫组织化学染色

切片脱蜡水化，3%H2O2甲醇灭活内源性过氧化物酶活性，依次滴加一抗(稀释比例均为1∶300)、二抗，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.4 RNA的提取和逆转录

使用TRIzol试剂对组织RNA进行提取，按照操作试剂盒的说明进行RNA逆转录，转录产物荣誉DEPC水中，保存于-20 ℃冰箱中待用。

1.5 PCR扩增及电泳

吸取逆转录产物5 μl进行PCR扩增，GAPDH作为内参物，引物由Invitrogen公司合成，其序列表见表1。KIF11、RhoA和Fascin扩增条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s，循环次数40次。取PCR反应后产物适量进行凝胶电泳(120 V，35 min)。最后进行电泳条带灰度值的半定量分析，重复5次，mRNA的相对表达量使用目的与内参条带的灰度值比值。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 结果判断

病理结果显示KIF11、RhoA和Fascin定位于上皮细胞的细胞质和(或)胞核，阳性判断标准为出现棕黄色颗粒。随机选取5个视野，着色细胞比例≤25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分；染色强度无着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕褐色为3分。最终得分为着色细胞比例和染色强度评分相乘，积<4分为阴性，≥4分为阳性。

1.7 统计学处理

数据处理应用SPSS 19.0软件进行，计数资料的比较，使用χ2检验，采用Spearman 相关分析法用于相关性的分析。P<0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 KIF11、RhoA和Fascin蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性率比较

KIF11主要在细胞质中表达，KIF11在口腔鳞癌组织中的阳性表达率为68.57%，而癌旁组织中KIF11的阳性表达率为7.14%，显著低于癌组织(P<0.05)；RhoA主要表达于细胞质，少量表达于细胞核，癌组织中RhoA阳性表达率为60.00%，而癌旁组织中RhoA阳性表达率为11.43%，显著低于癌组织(P<0.05)；Fascin主要表达于细胞质，癌组织中Fascin阳性表达率为64.29%，而癌旁组织中Fascin阳性表达率为12.86%，显著低于癌组织(P<0.05)，见表2。

表2 KIF11、RhoA和Fascin蛋白在癌组织及癌旁组织中阳性率比较(例，%)

2.2 KIF11、RhoA和Fascin mRNA表达水平比较

结果显示，KIF11、RhoA和Fascin mRNA在口腔鳞癌组织中的相对表达量分别为0.125±0.067，0.108±0.052和0.116±0.061，明显高于三者在癌旁组织中的相对表达量0.011±0.006，0.034±0.013和0.021±0.009，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 KIF11、RhoA和Fascin mRNA表达水平比较

2.3 KIF11、RhoA和Fascin蛋白表达与口腔鳞癌临床特征的关系

KIF11、RhoA和Fascin蛋白表达与口腔鳞癌分化程度、颈淋巴结转移、临床分期及肿瘤直径有关(P<0.05)，与年龄和性别无相关性(P>0.05)，见表4。

表4 KIF11、RhoA和Fascin mRNA表达水平与口腔鳞癌临床特征的关系(例，%)

2.4 相关性分析

Spearman 相关分析显示，KIF11蛋白与RhoA蛋白表达呈正相关(γ=0.479，P<0.05)，Fascin与RhoA蛋白表达呈正相关(γ=0.521，P<0.05)。

3 讨论

目前口腔鳞癌的病因和发病机制仍不清楚，但是越来越多的肿瘤标志物被发现，可用于口腔鳞癌的诊断，治疗和预后[10-11]。KIF11主要与细胞分裂中双极纺锤体的形成和分离以及中心体的分离有关。KIF11在大多数口腔癌细胞和组织中都有表达，但在健康的舌组织中几乎没有检测到。有研究发现抑制KIF11的表达可以促进肿瘤细胞的凋亡，KIF11在口腔鳞癌中的生长和生存中起关键作用，可以成为口腔鳞癌的诊断、治疗和预后因素[12]，但相关研究较少。本研究中癌组织中KIF11的阳性表达率为68.57%，显著低于癌旁组织中KIF11的阳性表达率7.14%(P<0.05)，KIF11 mRNA在口腔鳞癌组织中的相对表达量分别为(0.125±0.067)，显著高于癌旁组织(0.011±0.006)(P<0.05)。结果提示KIF11可作为口腔鳞癌诊断的标志性蛋白。另外KIF11蛋白阳性表达与口腔鳞癌分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，结果显示KIF11蛋白阳性表达率越高，肿瘤的恶性程度越高，但是其与年龄和性别无关(P>0.05)，提示KIF11蛋白可作为判断口腔鳞癌分化程度等的标志性蛋白。Kayo等研究显示KIF11在99个口腔癌组织中表达率为64.6%，但在健康口腔上皮中没有表达，KIF11可能是口腔癌的一个潜在的预后生物标志物和治疗靶点，与本研究结果一致[12]。

RhoA广泛参与肌动蛋白的细胞骨架重组、细胞黏附、细胞运动等涉及肿瘤侵袭和转移的各个环节的调控，在肿瘤发生发展、侵袭和转移过程中有着重要作用[13]。研究发现在肝癌、乳腺癌、睾丸癌等恶性肿瘤中均发现RhoA存在异常表达，其上调和(或)过表达与不良预后相关[14]。本研究中癌组织中RhoA蛋白的阳性表达率为60.00%，显著低于癌旁组织中RhoA的阳性表达率11.43%(P<0.05)；RhoA mRNA在口腔鳞癌组织中的相对表达量(0.108±0.052)，显著高于癌旁组织(0.034±0.013)(P<0.05)。以上结果提示RhoA蛋白可作为口腔鳞癌诊断的标志性蛋白。另外RhoA蛋白阳性表达与口腔鳞癌分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，说明RhoA蛋白阳性表达率越高，口腔鳞癌的恶性程度越高，但是其与年龄和性别无关(P>0.05)，提示RhoA蛋白可作为判断口腔鳞癌分化程度等的标志性蛋白。王莹等研究发现RhoA在口腔鳞癌组织中的阳性表达率为80.0%，作者推测RhoA可能与口腔癌的发生发展密切相关[15]。此结果与本研究结果相一致。

Fascin蛋白活性与癌细胞的运动、细胞的转移有密切关系[8]。研究发现随着Fascin基因表达的增加，细胞分化程度降低，细胞运动性和侵袭能力均增强[16]。另有研究发现随着肿瘤浸润能力的增强，Fascin蛋白的数量会增多，说明其在口腔鳞癌在肿瘤的浸润转移中发挥作用[9]。本研究中口腔鳞癌组织中Fascin的阳性表达率为64.29%，显著低于癌旁组织中Fascin的阳性表达率12.86%(P<0.05)；Fascin mRNA在口腔鳞癌组织中的相对表达量(0.116±0.061)，显著高于癌旁组织(0.021±0.009)(P<0.05)。以上结果提示Fascin蛋白可作为口腔鳞癌诊断的标志性蛋白。另外Fascin蛋白阳性表达与与口腔鳞癌分化程度、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05)，说明Fascin蛋白阳性表达率越高，肿瘤的恶性程度越高，但是其与年龄和性别无关(P>0.05)，提示Fascin蛋白可作为判断口腔鳞癌分化程度等的标志性蛋白。

以往研究显示KIF驱动蛋白可以改变RhoA GTP酶信号，当KIF驱动蛋白缺失时细胞中的RhoA活性下降[17]。另外Jayo等发现Fascin-1是Rho的功能靶点，Rho也能调节Fascin-1和肌动蛋白的相互作用[18]。本研究显示口腔鳞癌患者中KIF11和Fascin的表达均与RhoA呈显著正相关，结果提示KIF11、Fascin和RhoA之间存在相互影响的关系，可能共同参与了口腔鳞癌的发生发展。

综上所述，KIF11、RhoA和Fascin蛋白过表达与口腔鳞癌的发生、分化程度等显著相关，共同参与了口腔鳞癌的发生发展，联合检测为临床上口腔鳞癌的诊断及预后提供了新的参考。