宫颈鳞癌患者组织中HIF-1α和VEGF的表达及在放疗中的意义

潘秀花 白 力 谢福川 江晓聪 蓝玉宏 肖 伟

宫颈癌属于1种女性恶性肿瘤，在临床极为常见，在发展中国家中，其发病率位居第一位[1]。长期以来，其5年生存率维持在约55%。目前，临床普遍认为[2]，放疗在宫颈癌的治疗中发挥着极为重要的作用，尤其是在中晚期宫颈癌的治疗中。虽然近年来，医学界在一定程度上改善了放疗技术设备，比如，应用了计算机、后装治疗技术、高能射线等，但是并没有在极大程度上改进宫颈癌的疗效，同时也没有在极大程度上提升患者的生存率，发生这一现象的原因主要为没有控制局部肿瘤、远处转移。相关医学研究表明[3]，肿瘤细胞乏氧是没有控制局部肿瘤、远处转移的主要诱发因素，肿瘤细胞对放射线敏感性在其持续性增长浸润等因素下降低，放疗副反应对有效治疗剂量的增加造成了限制，对放疗治疗疗效造成了不良影响。实验证实[4-5]，和乏氧条件相比，有氧条件下细胞具有显著较高的敏感性，肿瘤细胞对放射治疗敏感性降低的主要原因为存在乏氧细胞。HIF-1a和VEGF均与肿瘤血管的发生密切相关，阻断HIF-1a从而使诱导VEGF的转录及表达减少，可抑制肿瘤血管的生成及肿瘤生长。本研究探讨了宫颈鳞癌患者组织中HIF-1α和VEGF的表达及在放疗中的意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

随机选取2016年8月至2018年8月我院宫颈鳞癌单纯放疗患者60例，随机分为2组：一组缓解组(30例)，一组未缓解组(30例)。缓解组患者年龄45～60岁，平均(47.4±7.6)岁。在肿瘤大小方面，20例≤4 cm，10例>4 cm；在临床分期方面，17例为ⅡB期，13例为ⅢA～B期；在病理分级方面，8例为高分化，12例为中分化，10例为低分化。未缓解组患者年龄46～60岁，平均(48.2±7.5)岁。在肿瘤大小方面，19例≤4 cm，11例>4 cm；在临床分期方面，16例为ⅡB期，14例为ⅢA～B期；在病理分级方面，9例为高分化，10例为中分化，11例为低分化。两组患者的一般资料比较差异均不显著(P>0.05)。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①临床资料均详细；②均经病理诊断为宫颈鳞癌；③均接受放疗治疗。排除标准：①活检前接受过放化疗治疗；②缺乏完整的临床资料；③合并其他严重疾病。

1.3 方法

1.3.1 治疗方法 采用高能X线治疗机对两组患者进行体外放疗，放疗技术采用三维适形放疗或三维适形调强放疗，剂量为95%PGTVn： 6 000 cGy/25次，95%PTV：4 500～5 000 cGy/25次，内照射采用高剂量率192铱后装治疗5～6次，A点剂量在3 000～3 600 cGy之间。

1.3.2 检测方法 购买北京博奥森生物技术有限公司生产的兔抗人HIF-1α多克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司生产的兔抗人VEGF单克隆抗体，日本Olympus公司生产的Olympus显微镜。数码医学图像分析系统为motic Med 6.0。运用免疫组化EM-vision二步法检测两组患者组织中HIF-1α和VEGF的表达，用10%福尔马林固定标本，常规脱水石蜡包埋，连续切片，厚度为3～4 μm。逐步脱蜡至水，用PBS进行10 min洗涤，共3次。用0.01的枸橼酸修复液进行15 min微波修复，凉至室温。室温下在3%过氧化氢中进行10 min作用。用PBS进行10 min的洗涤，共3次。再次用PBS进行10 min的洗涤，共3次。将兔抗人HIF-1α抗体和兔抗人VEGF抗体加入，工作浓度分别为1∶300、1∶100。在4 ℃的温度下过夜。用PBS进行10 min的洗涤，共3次。将通用型二抗添加其中，在37 ℃的温度的温箱中放置25 min。用PBS进行10 min的洗涤，共3次。显色，在此过程中将新鲜配置的DAB显色液充分利用起来，用流水进行10 min的冲洗，用苏木精进行5～10 min的复染，用流水进行1 min的返蓝，依次脱水、透明、封固，之后封片，在此过程中将中性树胶充分利用起来。显微镜下对结果进行判断并采图。

1.4 结果判定

HIF-1α阳性细胞呈棕黄色，则胞核或胞质上定位，高倍镜下(×400)将5个视野从每张切片中随机选取出来，对200个细胞/视野进行计数，共计1000个，阳性细胞数<1%、1%～10%、11%～50%、>51%分别评定为-、+、++、+++[6]；VEGF阳性细胞呈棕黄色，在胞质上定位，依据切片中着色细胞数量比率分类，<5%、6%～25%、26%～50%、>51%分别评定为-、+、++、+++[7]。

1.5 统计学分析

计数资料用率表示，用χ2检验。用Pearson相关性分析分析相关性，应用SPSS 21.0，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较

两组患者的一般资料比较差异均不显著(P>0.05)(表1)。

2.2 两组患者HIF-1α表达比较

60例患者中，HIF-1α表达阳性47例，阳性率为78.3%，其中未缓解组患者的HIF-1α表达阳性率[90.0%(27/30)]，显著高于缓解组[66.7%(20/30)](P<0.05)。具体见表2。

2.3 两组患者VEGF表达比较

60例患者中，VEGF表达阳性39例，阳性率为65.0%，其中未缓解组患者的VEGF表达阳性率[80.0%(24/30)]显著高于缓解组[50.0%(15/30)](P<0.05)。具体见表3。

表1 两组患者的一般资料比较(例，%)

表2 两组患者HIF-1α表达情况比较(例，%)

表3 两组患者VEGF表达比较(例，%)

2.4 两组患者HIF-1α和VEGF表达的相关性分析

未缓解组患者HIF-1α与VEGF表达呈显著正相关关系(γ=0.958，P<0.05)，但缓解组患者的HIF-1α与VEGF表达无相关性(γ=0.670，P>0.05)。

3 讨论

近年来，临床不断深入地研究了肿瘤，相关医学研究表明[8-10]，在生长过程中，肿瘤特别是实体恶性肿瘤极易有缺氧现象发生。缺氧细胞会放射治疗、化学治疗，因此亟待临床将1个可靠的代表缺氧的标志寻找出来来对治疗的合理性进行评价。现阶段，相关医学研究表明[11-12]，肿瘤细胞局部缺氧主要对缺氧诱导因子-1(HIF-1)的产生进行诱导，其属于1种转录因子，在特异性低氧状态下将活性发挥出来，其组成成分为α亚基、β亚基，HIF-1α是HIF-1α特有的，HIF-1β是HIF-1的组成性表达。HIF-1α属于1种氧调节蛋白，对HIF-1活性具有决定性作用。细胞中的HIF-1α在缺氧等应激条件下被激活，使机体、组织、细胞将一系列适应性反应产生，从而对供氧平衡进行维持，在多种肿瘤的恶性转化中参与，为肿瘤生长提供良好的前提条件。

丰富的营养供给在恶性肿瘤的持续性生长、转移过程中发挥着不可或缺的作用，在恶性肿瘤生长、侵袭、转移中，对新生血管生成进行诱导是1个前提条件，如果未生成血管，那么原发肿瘤的生长厚度到约107个细胞就不再增大，或生长不会超过1～2 mm3。肿瘤组织中血管生成将重要的基础条件提供给了氧气、营养物质向肿瘤组织进入、将代谢产物向组织细胞外运出、肿瘤细胞向靶器官迁移。血管生成确定则肿瘤生长、转移，肿瘤细胞能够将众多的血管生成因子分泌出来。其中，现阶段，VEGF作为1种血管生成促进因子最为关键，在肿瘤血管生成的参与调控因子中，其占有重要地位，能够和血管内皮细胞特异性结合，为内皮细胞生长提供良好的前提条件，促进血管通透性的增加，进而为血管生成提供良好的前提条件[13-14]。

肿瘤组织局部缺氧会将VEGF基因的表达水平上调，该作用和HIF-1α关系密切，在基因水平上，活化的HIF-1α对VEGF表达进行直接调控，能够增强VEGF的稳定性，同时促进VEGF转录活性的增加，为肿瘤血管形成提供良好的前提条件，使其对缺氧环境进行适应，同时抵抗放化疗。此外，肿瘤血管形成将良好的条件创造给了肿瘤的不断增大、远处转移、局部浸润。相关医学研究表明[15]，在宫颈癌放射治疗过程中，HIF-1α和VEGF可能发挥着主要作用，在预测宫颈癌放射治疗疗效及患者预后的过程中，可以将其作为1个参考指标。同时，在宫颈癌治疗中，HIF-1α和VEGF也可能能够作为新参考指标。本研究结果表明，60例患者中，HIF-1α表达阳性47例，阳性率为78.3%，其中未缓解组患者的HIF-1α表达阳性率90.0%(27/30)显著高于缓解组66.7%(20/30)(P<0.05)。60例患者中，VEGF表达阳性39例，阳性率为65.0%，其中未缓解组患者的VEGF表达阳性率80.0%(24/30)显著高于缓解组50.0%(15/30)(P<0.05)。未缓解组患者的HIF-1α和VEGF的表达呈显著的正相关关系(P<0.05)，但缓解组患者的患者的HIF-1α和VEGF的表达无相关性(P>0.05)，和上述相关医学研究结果一致。

总之，宫颈鳞癌放疗缓解患者组织中HIF-1α和VEGF的表达阳性率显著低于放疗未缓解患者。