肺部感染患者痰液与肺泡灌洗液病原菌分布及培养结果分析

秦 蓉 ，何 平，张颐豪，王砚春

1. 上海交通大学基础医学院免疫学与微生物系，上海 200025；2. 上海交通大学医学院附属仁济医院南院检验科，上海 201114；3. 复旦大学 附属肿瘤医院检验科，上海 200032

肺部感染是全球发病率最高的感染性疾病[1]。由于该类感染涉及的病原菌众多，在无法进行准确的病原学诊断前，多数医师不得不采取经验治疗[2]。为充分掌握肺部感染致病菌的病原菌及药敏特点，提高疾病治疗的效果，降低口腔细菌的污染率[3]，临床常采用纤维支气管镜提取患者的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）作为下呼吸道样本进行病原菌的培养（即金标准），从而指导临床抗生素的使用[4-5]。然而，作为临床上最为常用的检验方法，痰液（sputum，SP）样本培养有着取样方便、操作容易等优点，但该方法的采样合格率因人而异，易受口腔定植菌群的影响，因此仅依赖SP 样本培养行病原菌诊断尚缺乏定论。为进一步探讨SP 样本的病原菌结果能否作为肺部感染的诊断标准，分析该样本与BALF 样本间是否存在较大差异及其培养的优缺点，本研究对2 种样本的培养结果进行比较分析，以期为临床上使用SP 培养作为常规检查（替代BALF 培养）提供有力的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性选取2018 年1 月—2019 年6 月于上海交通大学医学院附属仁济医院南院就诊的肺部感染患者313 例，其中男性169 例、女性144 例，平均年龄（57.51±14.50）岁。

纳入标准：①所有患者均需符合我国肺部感染诊断标准[6]。②新近出现咳嗽、咳痰，或原有呼吸道疾病加重，并出现脓性痰。③发热。④肺实变体征和/或湿性啰音。⑤白细胞计数>10×109/L 或<4×109/L。⑥胸部X 线检查显示片状、斑片状浸润阴影或间质性改变。

本研究已通过上海交通大学医学院附属仁济医院伦理委员会审批（审批号：2016075）。由于本研究中所有数据均为匿名使用，且不包含受保护者的个人健康信息，因此伦理委员会批准了可放弃知情同意的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集 采用自然咳痰法或一次性吸痰管法对SP 样本进行采集。采用1T-180 型纤维支气管镜（Olympus，日本）对BALF 样本进行采集，具体步骤如下：向需要灌洗的肺段注入2%利多卡因1 ～2 mL进行局部麻醉。经活检孔快速注入37 ℃灭菌生理盐水，每次25 ～50 mL，总量100 ～200 mL。立即采用50 ～100 mmHg 负压吸引、回收BALF，并通过双层无菌纱布过滤以除去黏液。而后，将BALF 装入无菌硅化玻璃容器并置于冰上，记录总量后立即送至检验科行后续研究。该2 种样本的采集时间间隔均在24 h 以内。

1.2.2 样本的筛选、培养、鉴定及分组 检验科微生物实验室参照《全国临床检验操作规范（第4 版）》对SP样本和BALF 样本进行质量筛查[7]。合格样本经常规培养18 ～24 h 后，利用VITEK 2Compact 全自动细菌鉴定及药敏系统（BioMérieux，法国）对细菌菌株进行鉴定分析，利用显色培养基（Chromagar，法国）、真菌鉴定卡（BioMérieux，法国）对真菌菌株进行鉴定分析[8]。其中，同一患者的该2 种样本的培养结果视为一组，共313 组。

1.2.3 样本培养结果的比较分析 针对本研究病原菌培养的定性结果，需行比较分析的指标如下：①细菌培养方面，将培养结果为口腔正常菌群生长定义为细菌阴性结果，其余培养结果定义为细菌阳性结果；将2 种或者以上细菌发生感染定义为细菌复数菌感染。②真菌培养方面，将培养结果为真菌培养5 d 未生长定义为真菌阴性结果，其余培养结果定义为真菌阳性结果；将2 种或者以上真菌发生感染定义为真菌复数菌感染。③细菌或真菌培养结果均为阳性或阴性被定义为定性一致，培养结果均为阳性但菌种不一致被定义为定性一致但菌种不符。④定性总一致率（完全符合率），即培养结果均为阴性或者阳性占总数的比例。⑤培养缺省，即为部分样本仅接受了1 种培养（细菌培养或真菌培养）。

1.3 统计学方法

应用SPSS 20.0 软件对研究数据进行统计分析。定性资料以百分率表示，组内比较采用一致性检验进行分析。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 2 种样本病原菌检测的总体情况分析

本研究对313 例肺部感染患者的BALF 样本与SP样本的总体培养结果进行分析，结果如图1 所示。具体来看，综合313 例患者样本的真菌与细菌培养结果发现，定性均为阳性或者阴性的样本总一致率为75.08%（235/313）。共287 例患者同时接受了2 种样本的真菌培养检测，8 例仅接受了BALF 样本的真菌培养检测，18例均未接受2 种样本的真菌培养检测（即BALF 样本缺失n=18，SP 样本缺失n=26）。共264 例患者同时接受了 2 种样本的细菌培养检测，1 例仅接受了BALF 样本的细菌培养检测，48 例均未接受2 种样本的细菌培养检测（即BALF 样本缺失n=48，SP 样本缺失n=49）。

由于存在部分缺失，在后续进行的病原菌分布与一致性比较时，本研究将去除相应缺失病例（26 例真菌培养，49 例细菌培养），以免对结果造成偏倚。

图1 313 例肺部感染患者的BALF 样本与SP 样本的总体培养结果Fig 1 Overall culture results of BALF and SP specimens from 313 patients with pulmonary infection

2.2 BALF 样本的培养结果及分析

本研究对纳入肺部感染患者的BALF 样本进行培养及病原菌分析，结果（表1）显示：在295 例接受BALF 样本真菌培养的患者中，有49 例检出为阳性，阳性率达16.61%（49/295），其中白假丝酵母菌、烟曲霉、光滑假丝酵母菌的检出率依次位列前三；在265 例接受BALF 样本细菌培养的患者中，有73 例检出为阳性，阳性率达27.55%（73/265），其中鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌的检出率并列第一，肺炎克雷伯菌位列第二。考虑到复数菌感染情况，表1 还列出了按菌株数量统计的占比，其中真菌复数菌感染菌株为51 株、细菌复数菌感染菌株为89 株，其分布与样本的阳性菌构成比相类似。

2.3 SP 样本的培养结果及分析

本研究对纳入肺部感染患者的SP 样本进行培养及病原菌分析，结果（表2）显示：在287 例接受SP 样本真菌培养的患者中，有75 例检出为阳性，阳性率达26.13%（75/287），其中白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、烟曲霉的检出率依次位列前三；在264 例接受SP 样本细菌培养的患者中，有67 例检出为阳性，阳性率达25.38%（67/264），其中鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌的检出率并列第一，铜绿假单胞菌位列第二。同样地，考虑到复数菌感染情况，对该样本的阳性菌及其菌株构成进行分析，其中真菌复数菌感染菌株为76 株、细菌复数菌感染菌株为80 株，结果显示2 种构成比相类似。

表1 BALF 样本的阳性菌及菌株构成Tab 1 Positive bacteria composition and strain composition of BALF specimens

表2 SP 样本的阳性菌及菌株构成Tab 2 Positive bacteria composition and strain composition of SP specimens

2.4 BALF 样本与SP 样本培养结果的比较分析

综合前述结果发现，BALF 样本与SP 样本的阳性真菌均以白假丝酵母菌、烟曲霉、光滑假丝酵母菌为主，阳性细菌则以鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌为主。因此，该2 种样本的主要阳性菌种及分布基本一致。

在真菌培养检测中，去除26 例培养缺省后，其真菌定性一致率为79.09%（227/287），包含1 例BALF 样本培养为丝状真菌混合白假丝酵母菌，而SP 样本培养为白假丝酵母菌单菌阳性的结果；定性不一致的培养菌种共60例。经一致性检验显示，2 种样本真菌培养结果具有显著一致性（P=0.000），但一致性较低（Kappa<0.40）（表3）。

表3 BALF 样本与SP 样本真菌培养结果的定性一致性分析Tab 3 Qualitative consistency analysis of fungal culture results of BALF and SP specimens

在细菌培养检测中，去除49 例培养缺省后，其细菌定性一致率为90.91%（240/264），包含5 例SP 样本培养有复数细菌生长而BALF 样本培养仅其中几种细菌生长，7 例BALF 样本培养有复数菌生长而SP 样本培养仅其中几种细菌生长，另有3 例定性均为阳性但菌种鉴定完全不一致的病例；定性不一致的培养菌种共24 例。经一致性检验显示，2 种样本细菌培养结果亦具有显著一致性（P=0.000），且一致性较好（Kappa>0.75）（表4）。

表4 BALF 样本与SP 样本细菌培养结果的定性一致性分析Tab 4 Qualitative consistency analysis of bacterial culture results of BALF and SP specimens

本研究培养结果定性均为阳性且菌种一致的病例数中，单数菌有68 例、复数菌有6 例，定性均为阳性但菌种不一致的单数菌为1 例、复数菌为16 例。因此，在阳性菌种水平的完全符合率方面：单数菌为98.55%（68/69），包括单数真菌100.00%（30/30）和单数细菌97.44%（38/39）；复数菌为27.27%（6/22），包括复数真菌50.00%（1/2）和复数细菌25.00%（5/20）。复数菌完全不符合率为9.09%（2/22），均是复数细菌，占复数细菌的10.00%（2/20）；复数菌部分不符合率为复数真菌4.55%（1/22）、复数细菌54.55%（12/22）。

3 讨论

近年来临床肺部感染的发病率较高，早期明确病原菌、精准选择抗生素是提高该疾病治愈率、降低其致死率的重要措施。临床上，SP 样本培养因常存在口腔菌群污染或难以取到病变部位使其应用受到限制。目前，临床肺部感染的初始治疗仍依赖于传统的经验用药[9]。随着医学技术的发展，如何明确病原菌特征成为保证有效治疗的关键，其也是合理使用抗菌药物的前提[10]。有研究报道，以纤维支气管镜获取下呼吸道样本的检测方法（即BALF 样本培养）优于常规SP 样本培养[11]，且兼具肺部检查和治疗功能[12]。另有研究[13]认为，常规SP 样本培养方法依旧是目前指导临床用药的主要病原学方法，但易受到菌群污染，限制了其对疾病诊断和指导治疗的临床应用。一项为期12 年的回顾性研究[14]发现，SP 与BALF的微生物学分析的一致性良好，其效率与有创采样方法相似，且其分析的成本效益更高。因此，SP 与BALF 培养结果间是否存在差异，且当SP 培养结果与临床相符时是否有必要再行BALF 培养，是本研究主要探究的 内容。

本研究中，通过分析SP 样本与BALF 样本的培养结果发现，该2 种样本的真菌检测一致率为79.09%，一致性检验显示该2 种样本的培养结果具有显著一致性；细菌培养检测一致率为90.91%，且培养结果亦具有显著一致性。因此，我们认为SP 样本与BALF 样本的培养结果间无显著差异。由于BALF 样本采集具有一定的创伤性，根据本研究结果我们推测，当SP 培养结果与临床症状相符合时，则无需再行BALF 培养，即临床上可优先参考SP培养结果。

然而，在本研究中SP 样本与BALF 样本的培养结果也存在部分不一致的情况：①在SP 样本培养为阳性真菌的患者中，有43 例BALF 样本培养结果为阴性，其中42（97.67%）例为假丝酵母菌。从临床角度分析，BALF 样本为阴性而SP 样本中有真菌生长，则可排除侵袭性肺部真菌感染，考虑为上呼吸道真菌的定植或样本污染，其SP 样本阳性对临床诊断意义不大，反而会影响临床对疾病的判断[15-16]。而去除上述43 例疑似定植真菌污染的结果，重新行一致性检验显示Kappa 值可提高至0.751，即SP 样本与BALF 样本的真菌培养一致性较好。而对于该43 例病例，由于SP 样本培养存在上呼吸道定植真菌污染的可能性较大，建议结合临床及时行BALF 样本检查，以排除侵袭性真菌感染的可能，从而判断是否为SP 假阳性污染并决定是否使用抗真菌药物治疗，在不延误患者病情的同时最大限度地避免过度治疗[17-18]。此外，本研究也发现另有少部分（9 例）SP 样本培养细菌阳性、BALF 样本培养细菌阴性的病例，临床上同样需考虑SP 样本可能存在上呼吸道细菌定植污染，不建议采取抗菌治疗。②有32 例（17 例真菌、15 例细菌）BALF 样本培养结果为阳性而SP 样本培养为阴性，这可能是由于患者自主取样意识较差、SP 样本不合格等原因导致的SP 样本培养假阴性结果。本研究发现，在这类患者中被检出有3 例耐碳青霉烯细菌和1 例耐甲氧西林细菌，存在多重耐药的可能。研究[19-20]表明，当SP 样本培养结果为阴性且临床症状与其他检测结果不符时，建议尽早采用BALF 样本培养，弥补SP 培养因样本的局限性而导致的漏检，同时配合病原菌药敏试验，以指导临床合理使用抗菌药物。③在本研究2 种样本细菌培养均为阳性的58 例病例中，包括了结果中描述的5 例SP 样本培养有复数细菌生长而BALF 样本培养仅其中几种细菌生长、7 例BALF 样本培养有复数菌生长而SP 样本培养仅其中几种细菌生长，以及3 例定性均为阳性但菌种鉴定完全不一致的病例。经查阅病史资料发现，该类患者多患有风湿病、重症肺部感染或多脏器疾病。为达到有效抗炎目的，临床上均可长期采用激素类药物和广谱抗菌药物对其进行治疗，因此该类患者的下呼吸道可能同时存在多种低丰度的病原菌，而由于2 种培养方法采样时存在随机选择优势菌的可能，因此最终的菌种鉴定结果会有所不同。

综上所述，本研究发现SP 样本与BALF 样本培养结果无显著差异。虽然SP 样本培养作为经典的病原学检验方法存在一定的优势，但经纤维支气管镜获取BALF 样本行病原学检测这一新方法不仅优于SP 样本培养，兼具有检查和治疗的功能，还被作为临床上的金标准；同时，SP样本培养结合临床仍可作为肺部感染的参考标准之一，可在一定程度上减少由BALF 采样带来的创伤；而当SP 样本培养结果与临床症状及影像学不相符，尤其是在高度怀疑侵袭性肺部真菌感染时，应及时采取BALF 样本检查。因此，对于疑似肺部感染患者，不仅需根据其病情、临床表征行血液检测、影像学检查等，还需结合SP 样本培养行病原学检查，以明确病原菌种类，及时行病原菌药敏试验，从而为临床合理使用抗生素及精准治疗提供一定的 参考。

参·考·文·献

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