一株血清9型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

薛 瑞，刘守川，赵坤坤，王迎迎，刘 杰*，闫文朝

（1.洛阳中科基因检测诊断中心有限公司，河南洛阳 471000；2.河南科技大学，河南洛阳 471000）

2019 年4 月河南某猪场出现部分猪发烧、呼吸困难等症状，发病猪四肢、耳朵背后、臀部有大片的红斑，剖检发现皮下出血，腹股沟淋巴结肿大出血，下颌淋巴结、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结也均有出血现象；肺有实变，间质增宽；心脏的心尖呈现钝圆状，心肌有轻微出血；肾表面有针尖状出血点，髓质有出血；四肢关节肿大，剖开关节，有清亮的胶冻样渗出物；脑膜剪开后，有少量积液。病理变化较为符合副猪嗜血杆病症状，为确定病原，为临床治疗提供帮助，无菌采取肺脏样品进行实验室细菌分离，经实验室检测结果分离到了副猪嗜血杆菌，血清型鉴定结果为9 型。

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，HPS）可引起猪的格氏病，是目前养猪生产中重要的细菌性呼吸道疾病。HPS 为上呼吸道常栖菌，只有在特定条件下才可能侵入机体并引起全身性疾病[1]，现在研究发现，在同一猪在不同时间或空间引起副猪嗜血杆菌病的病原血清型都不一样，需要对其血清型进行鉴定，以利于预防副猪嗜血杆菌。此外副猪嗜血杆菌通常作为继发的病原存在[2-4]，通常由猪繁殖与呼吸综合征、圆环病毒、猪流感和猪呼吸道冠状病毒引起。

1 材料和方法

1.1 剖检取样

根据临床症状和病理特征，无菌选取肺脏心叶部分进行细菌分离鉴定。

1.2 主要培养基和试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），购自青岛海博试剂有限公司；新生牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司；氧化型辅酶I（NAD），购自上海生工生物工程股份有限公司；哥伦比亚血琼脂基础，购自青岛海博试剂有限公司；革兰氏染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司；细菌微量生化管及药敏纸片，购自杭州微生物试剂有限公司；病毒核酸提取试剂盒，购自台湾旭基；10×PCR Buffer、dNTPs、DNA Taq 酶、DNAmarker、6×loading buffer 等购自宝生物（大连）工程有限公司。

1.3 细菌分离

无菌剪取肺脏样品，分别接到血平板和TSA+血清+NAD 培养基上，37 ℃培养24 h，观察菌落生长形态，挑取单菌落进行纯化培养。

对纯化培养后的菌株进行革兰氏染色镜检和常规细菌生化试验，挑取单菌落涂抹于载玻片上，滴加3%H2O2，观察有无气泡产生。

1.4 卫星试验生化鉴定

取一块没有添加NAD 的TSA 血清平板，在平板中间沿直径线涂划接种金黄色葡萄球菌，然后将可疑单菌落垂直金黄色葡萄球菌线划线接种，37 ℃培养24 h，观察是否出现靠近金黄色葡萄球菌线的菌落长势较好、远离金黄色葡萄球菌线的地方无菌落生长的卫星现象。

选取生化鉴定试管进行试验时特别注意在生化鉴定管内添加适量NAD。

1.5 分子鉴定及测序

根据副猪嗜血杆菌16S rRNA 基因，张盼峰等[5]设计了一对特异性引物，引物序列为：P1:5’-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3’，P2：5’-GTG ATG AGG AAG GGT GT-3’，扩增出的目的片段大小为821 bp，该引物由英潍捷基（北京）贸易有限公司合成。

PCR 采用 25 μL 反应体系，即 10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、DNA Taq 酶 0.5 μL，上下游引物各 1.0 μL（10 pmol/μL），DNA 模板 2.0 μL（25 ng/μL），ddH2O 16.0 μL。PCR 反应条件为：95 ℃ 5min，94 ℃60 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共 30 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物经1.5 %琼脂糖凝胶电泳鉴定，剩余产物送通用生物公司测序。

对测序结果用DNASTAR 软件处理，并与NCBI中已发表的基因序列进行同源性比较，选取同源性最高菌株的基因序列，采用DNASTAR-MEGALIGN软件进行多重序列比对分析，并构建系统进化树。

1.6 多重PCR血清型分型

参照K.J.Howell 等[6]报道提供的引物进行血清型分型，引物序列见表1。

挑取单个菌落进行血清型分型，多重PCR 采用25 μL 反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、DNA Taq 酶 0.5 μL，各引物上下游 0.25 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 11.0 μL。

多重 PCR 反应条件为：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共 30 个循环；68 ℃ 5min。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 血清型多重PCR 引物序列Table 1 The sequences of multiplex PCR on serotype

1.7 药敏试验

挑取疑似单个菌落接种于TSB+血清+NAD 液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床培养5～6 h，取100 μL均匀涂布于TSA+血清+NAD 培养基上。用纸片琼脂扩散法（K-B 法）[7]进行药敏试验，选取头孢噻呋、阿莫西林、阿米卡星、硫酸黏菌素、甲砜霉素、恩诺沙星、卡那霉素、庆大霉素、多西环素和氟苯尼考为试验药物，37 ℃培养16～18 h 后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，根据说明书敏感和耐药性的最小抑菌圈直径判定菌株对所选药物的敏感程度。

2 结果

2.1 细菌分离结果

肺脏有实变，间质增宽；四肢关节肿大，剖开关节，有清亮的胶冻样渗出物（见图1）。

TSA+血清+NAD 平板上生长有表面光滑、小而透明的菌落（见图2），革兰氏染色为阴性杆菌（见图3），呈多形性，触酶阳性。心叶支气管内容物直接触片革兰氏染色可见阴性杆菌（见图4）。

2.2 卫星试验及生化鉴定结果

分离株在血清平板上不生长，由图5 可知分离株在靠近金黄色葡萄球菌直线处生长较好，而远离直线的地方基本没有细菌生长。

从表2 得到，分离到的菌株不发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖，氧化酶和尿素酶阴性，硝酸盐还原酶和接触酶阳性，靛基质和VP 试验阴性。与副猪嗜血杆菌的生化特性一致。

2.3 分子鉴定结果

取单个纯化且具有典型特点的菌落进行PCR鉴定，并设阳性和阴性对照。由图6 可知阳性对照电泳条带大小为821 bp，样品扩增出了821 bp 左右的特异性条带，阴性对照无条带，与16SrRNA 引物扩增的基因片段长度相符，根据结果可判定为副猪嗜血杆菌。

图1 病猪病理形态Figure 1 Pig pathological morphology

图2 TSA+血清+NAD 平板上菌落形态Figure 2 The colony morphology of TSA+NBCS+NAD plate

图3 革兰氏染色镜检（1 000×）Figure 3 Microscopic morphology of HPS（1 000×）

图4 心叶支气管内容物染色(1 000×)Figure 4 Bronchial contents in cardiac lobe（1 000×）

图5 卫星现象Figure 5 The result of Satellite test

表2 生化鉴定结果Table 2 The result of biochemical test

图6 副猪嗜血杆菌PCR 鉴定结果Figure 6 The molecular identification result of HPS

2.4 细菌16SrRNA测序、系统进化树构建及同源性分析

由图7 和图8 可知，样品与副猪嗜血杆菌NR_118757.1 的同源性为98.6%，说明该菌株为副猪嗜血杆菌。

2.5 血清型多重PCR结果

经鉴定为副猪嗜血杆菌后，取单个菌落进行多重PCR 血清型鉴定，由图9 可知样品扩增出了700bp 左右的特异性条带，阴性对照无条带，将PCR产物送去测序，序列如下：

序列经过比对后与GenBank 公布的KC795429.1副猪嗜血杆菌funV 同源性达99.85%，根据表1 所示判断是9 型血清型。

图7 系统发育树Figure 7 The phylogenetic tree

2.6 药敏试验结果

分离到的细菌对头孢噻呋、阿米卡星、硫酸黏菌素、甲砜霉素、卡那霉素、庆大霉素、多西环素、氟苯尼考高敏；对阿莫西林、恩诺沙星耐药，如表3。

3 讨论

副猪嗜血杆菌病是猪的一种常见疫病，主要症状为呼吸困难，关节肿大，少数猪有神经症状，临床上病理变化主要以胸腔、腹腔和关节等部位出现纤维素性渗出为主。实验室选择根据采样条件及运输条件以肺脏为主，但是由于其临床病理变化与猪肺疫、传染性胸膜肺炎、链球菌等很难明确区分，所以应以实验室结果为最终判断标准。目前，副猪嗜血杆菌的分离较难以进行主要原因有：1）样品选择和保存条件，副猪嗜血杆菌在4 ℃条件下仅能存活1天，而样品从采集到实验室，因为保存问题使其极难分离，肺脏底缘薄，为从第6 根骨肋软骨交界处至第11 肋骨上端的弧线，在临床诊断上具有重要意义，故而以肺脏为主要分离样品；2）样品原因，肺脏属于开放性器官，而且呼吸道中细菌较杂，而在实验室条件下能生长的菌也较多，对细菌分离有巨大的干扰；3）人员因素，细菌分离操作方法较为简单，但是对操作人员素质要求较高，需要对样品中的菌群和疫病有较深认识，且对细菌知识需要有系统性学习，尤其细菌形态学和基本生化条件有简单认知；4）细菌鉴定方法不正确，目前对于细菌鉴定，各实验室基本只是通过PCR 的方法进行，这个方法严重影响副猪嗜血杆菌的分离，因为PCR 的方法因为敏感度和细菌结构等因素的影响极容易出现假阴性的情况。针对以上因素建立了副猪嗜血杆菌分离鉴定的初步方法，以完整肺脏的心叶为主要操作对象，以国际通用的《伯杰细菌鉴定手册》[8]为主要参考依据，发现其菌落形态基本为光滑透明菌落与在同样条件下的巴氏杆菌菌落形态完全不一样，触酶阳性又可快速区分链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌，革兰氏染色阴性杆菌排除阳性菌的可能，“卫星现象”进行区分传染性胸膜肺炎放线杆菌，根据肺脏的菌群和培养条件，极大地提高了副猪嗜血杆菌的分离鉴定效率，降低了操作人员的技术要求，节约了成本。

随着对抗生素使用的约束，细菌病的预防成了临床关注的重点。目前副猪嗜血杆菌的血清型鉴定的金标准仍然是通过使用阳性血清进行血清型分型[9-11]，但是这种方法对于临床有较大的限制，需要有标准菌株和熟练的操作人员，以降低交叉性反应的可能和提供稳定的阳性血清。随着分子方法的不断发展和对基因序列研究的加深，现阶段使用较多的方法主要是肠杆菌基因重复序列PCR（ERIC-PCR）和限制性片段长度多态性PCR（PCR-RFLP）。ERICPCR 技术是建立在重复序列PCR（Rep-PCR）基础上的一种方法，利用ERIC 中的保守序列设计一对反向引物，扩增细菌基因组中的未知序列并产生具有特异性的指纹图谱，达到对不同菌株分型的目的[12]。但是ERIC-PCR 指纹图谱方法对人员素质的要求比较高，不利于在临床中推广。PCR-RFLP 指纹图谱是在PCR 和DNA 序列分析基础上产生的限制性片段长度多态性技术，通过PCR 扩增一段DNA 片段，然后选择适当的限制性内切酶，消化PCR 产物，经电泳得到特异性的电泳谱带，达到鉴定不同基因型的目的，但是此方法成本高，人员素质要求高。而本文提到的多重PCR 方法能够降低了技术要求和成本，提高了日常检测的效率，对于猪场或存在多种血清型的情况，可以快速地检测，操作简单，容易普及推广，适用于临床快速检测诊断和流行病学调查。

图9 多重PCR 分型结果Figure 9 The result of multiplex PCR

表3 药敏试验结果Table 3 The results of antibiotic sensitivity tests