循环肿瘤细胞与肿瘤标志物在肺癌诊断中的价值比较*

吴 方，赵 京，张 侠，郭沛艳，杨家树，刘 杰△

(1.南方医科大学第二临床医学院，广东广州 510280；中国人民解放军总医院第七医学中心: 2.检验科;3.胸外科;4.肿瘤科;5.呼吸内科，北京 100700)

肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率在各类恶性肿瘤中均居首位[1]，早期诊断对疗效及延长患者生存期限具有重要意义[2]。由于患者早期并无明显症状及当前检查手段自身的局限性，致使60%～80%的患者确诊时已是中晚期而错失了最佳治疗时机[3]。循环肿瘤细胞(CTCs)来源于肿瘤原发灶或转移灶，在肺癌的诊断中具有潜在应用价值[4]。本研究将CTCs与传统血清肿瘤标志物进行比较分析，从而探讨CTCs在肺癌中的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年9月至2019年7月中国人民解放军总医院第七医学中心收治的且经病理检查确诊的肺癌患者35例作为肺癌组，其中男性27例，女性8例，年龄40～88岁，平均(60.7±9.6)岁，根据第8版国际肺癌TNM分期标准：Ⅰ期患者10例、Ⅱ期患者6例、Ⅲ期患者3例、Ⅳ期患者16例；大细胞癌1例、鳞癌8例、肉瘤1例、腺癌13例、腺鳞癌3例、小细胞癌9例。选取同期入院的非结核肺良性疾病者以及健康体检者共48例作为对照组，其中男性38例，女性10例，年龄31～98岁，平均(61.0±17.6)岁；非结核肺良性疾病均为肺炎、慢性阻塞性肺疾病等呼吸系统疾病。两组患者一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)年龄18～98岁；(2)经组织病理学检查确诊为肺癌；(3)入组前未接受任何抗肿瘤治疗；(4)患者知情同意。排除标准：(1)缺乏病理学诊断；(2)已接受手术、化疗等任何治疗；(3)依从性较差。

1.2方法

1.2.1CTCs检测方法 用含ACD保养液的真空采血管抽取纳入研究者(患者在入院接受治疗前)空腹静脉血5 mL，使用人外周血白细胞去除试剂盒(江苏莱尔生物医药科技有限公司)对CTCs进行富集，使用荧光原位杂交样品处理试剂盒(江苏莱尔生物医药科技有限公司)对CTCs进行鉴定，即使用CD45对白细胞进行标记；使用DAPI对细胞核进行标记；使用CEP8探针对着丝粒进行标记。

1.2.2血清肿瘤标志物检测方法 患者入院接受治疗前，用红色真空采血管抽取其空腹静脉血5 mL，4 000 r/min离心5 min，使用罗氏Cobas e601全自动化学发光免疫分析仪及其配套试剂对癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原153(CA153)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)进行检测；使用新产业Maglumi 4000 Plus型全自动化学发光测定仪及其配套试剂对鳞状细胞癌相关抗原(SCCA)进行检测。操作步骤严格按照仪器及试剂说明书进行。

1.2.3CTCs阳性判断标准 (1)单个细胞，核质均匀，未发现分层；(2)探针信号三个或三个以上；(3)CD45不显色；(4)细胞表面无或仅一颗磁珠。见图1。

图1 荧光显微镜下对白细胞及CTCs的鉴别(400×)

1.2.4参考范围 血清肿瘤标志物正常值：CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，NSE 0～16.3 ng/mL，SCCA 0～2.5 ng/mL，CEA 0～5 ng/mL，CA125 0～35 U/mL，CA153 0～25 U/mL；CTCs正常值：0～1个/3.2 mL。

1.3统计学处理 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析处理，以ROC曲线对CTCs在肺癌中的诊断效能进行评价；计数资料以频数及百分比[n(%)]表示，组间差异比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肺癌组和对照组CTCs阳性率比较 应用免疫磁珠阴性富集结合荧光原位杂交技术对两组患者外周血CTCs进行检测，肺癌组阳性率为77.1%(27/35)，高于对照组CTCs阳性率10.4%(5/48)，差异具有统计学意义(χ2=38.042，P=0.000)。

2.2CTCs与传统血清肿瘤标志物诊断肺癌的灵敏度及特异度比较 以病理诊断为金标准，整理CTCs对肺癌诊断的四格表资料，见表1。CTCs检测在肺癌诊断中的灵敏度及特异度分别为77.1%、89.6%，见表2，均高于传统血清肿瘤标志物NSE(42.9%、77.1%)、CA125(34.3%、87.5%)、CA153(11.4%、89.5%)、CYFRA21-1(62.9%、64.6%)、SCCA(22.9%、66.7%)；而CEA的特异度为93.8%，虽高于CTCs(89.6%)，但其灵敏度(45.7%)要低于CTCs(77.1%)。

表1 CTCs对肺癌诊断的四格表资料(n)

表2 CTCs与传统血清肿瘤标志物诊断肺癌的灵敏度及特异度(%)

2.3CTCs与传统血清肿瘤标志物诊断肺癌的ROC曲线分析 以病理诊断为金标准，以35例肺癌患者为疾病组，以48例健康者及肺良性疾病为对照组，如图2所示，CTCs诊断肺癌的曲线下面积为0.865(95%CI:0.779～0.952)，其曲线下面积均高于CEA(0.793)、NSE(0.591)、CA125(0.706)、CA153(0.530)、CYFRA21-1(0.674)、SCCA(0.336)，ROC曲线分析结果显示CTCs检测对肺癌的诊断价值均比传统血清肿瘤标志物高。

图2 CTCs与传统血清肿瘤标志物诊断肺癌的ROC曲线分析

2.4传统血清肿瘤标志物联合检测与CTCs诊断肺癌的灵敏度及特异度比较 联合检测时,有一项指标阳性便判定检测结果为阳性。如表3所示，CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA联合检测的灵敏度为94.3%，高于CTCs检测的灵敏度(77.1%)，差异有统计学意义(χ2=4.200，P=0.04)；但CTCs检测的特异度(89.6%)显著高于6项肿瘤标志物联合检测的特异度(33.3%)，差异有统计学意义(χ2=32.059，P=0.000)。

表3 6项血清肿瘤标志物联合检测与CTCs诊断肺癌的灵敏度及特异度(%)

2.5CTCs阳性与肺癌患者病理类型的关系 CTCs的阳性与肺癌患者的病理类型无关(χ2=1.772，P=0.880>0.05),见表4。

表4 CTCs阳性与肺癌患者病理类型的关系[ n(%)]

3 讨 论

癌症是全球的公共卫生问题，根据世界卫生组织(WHO)2015年的估计，癌症是导致91个国家70岁前死亡的第一或第二主要原因[5]，而在2018年的1 810万例新发癌症病例(肺癌占11.6%)和960万癌症死亡病例(肺癌占18.4%)中，肺癌均居首位[5]。在我国，肺癌的发病例数(约78.7万例)及病死率(约63.1万例)依然居各恶性肿瘤之首[1]，而且发病率还在逐年上升[6]，严重影响了我国人民的身体健康，也给社会和个人带来了极大的经济负担。对于肺癌，只有早期诊断、早期治疗，才会获得好的疗效，但由于目前诊断手段自身的局限性[7]，致使60%～80%的肺癌患者因确诊时已是中晚期而失去了最佳的治疗时机[3]。

1869年，一名澳大利亚医生在1例因肿瘤而死亡的患者外周血里发现了CTCs并因此首次提出了CTCs的概念[8]，CTCs来源于肿瘤原发灶或转移灶，在肿瘤早期就可以进入血液循环，因此在肿瘤的早期诊断中具有重要应用价值。CHEN等[9]的研究发现，CTCs检测在原发性肺癌及良性肺病和健康人组成的对照组中的阳性率分别为84.0%、4.2%，本研究也得到了同样的结果，这提示CTCs检测在肺癌的诊断中具有一定的应用价值。此外，在传统的血清肿瘤标志物里，有研究者发现CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA在肺癌诊断中均具有一定价值，各项指标的灵敏度及特异度分别为42.50%、100.00%，47.67%、84.78%，34.88%、88.04%，17.50%、92.50%，64.44%、61.11%，30.20%、78.50%[10-12]。为了对CTCs检测在肺癌中的诊断效能进行评价，本研究将CTCs在肺癌诊断中的灵敏度及特异度与传统的血清肿瘤标志物进行了比较分析。结果显示，CTCs在灵敏度方面高于传统血清肿瘤标志物，而在特异度方面，CTCs高于NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA，仅低于CEA，但CEA的灵敏度要远低于CTCs，说明CTCs检测在肺癌的诊断中具有较高的灵敏度和特异度，具有较低的漏诊率及误诊率，这与YE等[13]的研究结果基本符合。为了进一步探索CTCs在肺癌中的诊断价值，本研究使用并联试验对六项肿瘤标志物进行联合检测，结果显示联合检测将肿瘤标志物的敏感性提高至94.3%，显著高于CTCs检测的灵敏度(77.1%)，但联合检测却降低了肿瘤标志物的检测特异度(33.3%)，远低于CTCs(89.6%)，这提示肿瘤标志物联合检测在肺癌的早期筛查方面会优于单项CTCs检测，而CTCs检测的费用较为昂贵，临床医师可先对可疑患者行肿瘤标志物的联合检测，当所有指标均阴性时，可嘱患者定期复查；当联合检测阳性时，CTCs检测具有较高的灵敏度及特异度，可做CTCs检测，以先于组织活检为临床医师提供参考。与此同时，本研究也使用ROC曲线对CTCs及传统血清肿瘤标志物在肺癌中的诊断价值进行了比较，结果显示，CTCs对肺癌诊断的ROC曲线下面积均高于CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA，说明CTCs检测对肺癌的诊断价值比传统的肿瘤标志物均要高，这与LI等[14]的研究结果基本符合。而在CTCs阳性表达与肺癌患者病理类型的关系分析中，发现CTCs在肺癌中的阳性表达与肺癌患者的病理类型无关，而传统的血清肿瘤标志物均与肺癌的病理类型有关：CEA在肺腺癌患者血清中会异常升高[12]；NSE常作为小细胞肺癌的血清标志物[15]；CA125在肺腺癌患者血清中会异常升高[16]；CA153在肺腺癌患者血清中会异常升高[10]；CYFRA21-1常作为非小细胞肺癌的血清标志物[12]；SCCA常作为肺鳞癌的血清标志物[12]。而CTCs在肺癌中的阳性表达不受肺癌病理类型的影响，因此，在应用于肺癌的诊断中时，更具有优势。但本研究因经费所限，也存在一些局限，即对照组样本量较少，但有研究者报道CTCs、CEA、NSE、CA125、CA153、CYFRA21-1、SCCA在肺良性疾病和健康组中差异无统计学意义[9,17-20]，因此本研究将肺良性疾病组和健康组合并为一组进行了探讨，与同类研究结果基本符合，结果较为可靠。

4 结 论

CTCs检测在肺癌的诊断中具有较高的灵敏度及特异度，可将其作为辅助肺癌诊断的一种手段。