张 莉,张小蒙
(江苏医药职业学院药学院,江苏盐城 224005)
嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体,是多种水生动物的原发性致病菌[1],为条件致病菌,是典型的人-兽-鱼共患病病原菌[2],嗜水气单胞菌的变异菌株较多,多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感,嗜水气单胞菌表现多种抗性[3],其中一个主要原因是含有多种质粒[4]。本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒,命名为质粒pBK760,该质粒具有多种位点和抗性,具有良好的载体特征。
pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体[5]。该载体以pUC19载体为基础,在其多克隆位点处的Xba I和BamH I位点之间增加了Spe I,Nde I,EcoRV3种酶切位点,经EcoR V酶切后再在两侧的3’端添加“T”制备而成[6]。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’端添加一个“A”的特性,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率[7]。
虽然质粒pBK760和pMD20均可单独作为载体来使用,但是如果可以将其优点相结合,就可以发挥它们各自的优势,本实验就结合质粒pBK760和pMD20两方面的优点,利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体(pBKPU01),便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。
1.1.1 质粒和载体
质粒pBK760由本实验室从嗜水气单胞菌中分离并保存,pMD20购自大连宝生物。
1.1.2 主要试剂
限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自大连宝生物;凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工;其他常规试剂为进口或国产分析纯。
根据质粒pBK760序列,采用Oligo 6.0软件设计1对特异性引物P1、P2,上游引物P1序列为:ATCGTCGACCCTCTAGATGCAG,下游引物P2序列为:CTGACTCTAGCAGGTCGAGGAT。引物由上海生工合成。
挑取嗜水气单胞菌单菌落,接种于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37℃培养12 h。菌液用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pBK760,-20℃储存待用。
以质粒pBK760为模板,通过设定引物(P1和P2)进行PCR,使环状质粒pBK760线性化,PCR的具体反应条件如表1所示。
反应程序为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72℃ 4.5 min,32循环;72℃延伸10 min;4℃保存。PCR扩增后的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将检验正确的片段纯化回收。
将线性化质粒pBK760和载体pMD20进行连接,反应体系如表2所示。
操作步骤如下:16℃连接过夜,取2.5μL连接产物转化50μL E.coli DH5α感受态细胞,取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选。挑取阳性转化子,转入5 mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基,37℃培养12 h,用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒,获得穿梭质粒载体pBKPU01。
表1 质粒p BK760线性化PCR反应具体条件
表2 质粒p BK760和载体p MD20连接体系
制备嗜水气单胞菌感受态细胞,用电转化方法转化感受态细胞[8],用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒,通过HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切验证。结果证明的确是质粒pBKPU01,说明构建的穿梭载体pBKPU01能够在嗜水气单胞菌中复制表达。确定重组质粒后进行测序分析(华大基因),序列分析结果和质粒pBK760序列相同,验证正确。
以P1、P2为引物,以质粒pBK760为模板进行PCR扩增,凝胶电泳结果如图1所示,成功扩增出长度为3 817 bp的质粒pBK760,与预期结果一致,可进行下一步实验。
对转化并提取的质粒pBKPU01通过HindⅢ和EcoRⅠ进行单、双酶切验证,酶切后均得到6 000 bp左右的片段,其他片段过小未能显示,与预期结果一致,凝胶电泳结果如图2所示。
以DNAMAN为工具[9],构建pBKPU01图谱,图谱如图3所示。该穿梭质粒载体包括位于3 355~3 561的启动子位点、位于3 726~3 812的信号肽编码基因、位于1 592~2 363的卡那霉素抗性基因、位于2531~2735的博来霉素抗性基因,位于347~676的lacZ基因以及位于1 833~2 693的氨苄青霉素抗性基因。
图1 质粒p BK760经PCR线性化后的凝胶电泳
图2 转化E.coli DH5α后提取的穿梭质粒载体p BKPU01单、双酶切鉴定电泳
图3 穿梭质粒载体p BKPU01图谱
嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体,是多种水生动物的原发性致病菌,为条件致病菌,是典型的人-兽-鱼共患病病原菌,嗜水气单胞菌的变异菌株较多,多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感,嗜水气单胞菌表现多种抗性,其中一个主要原因是含有多种质粒,本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒,命名为质粒pBK760,该质粒具有多种位点和抗性,具有良好的载体特征。
pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体。该载体以pUC19载体为基础,在其多克隆位点处的Xba I和 BamH I位点之间增加了 Spe I,Nde I,EcoR V3种酶切位点,经EcoR V酶切后再在两侧的3’端添加“T”制备而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’端添加一个“A”的特性,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率[10-13]。
虽然质粒pBK760和pMD20均可单独作为载体来使用,但是如果可以将其优点相结合,就可以发挥它们各自的优势,本研究就结合质粒pBK760和pMD20两方面的优点,利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体(pBKPU01),便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。