细胞色素B基因检测方法在物种鉴定中的应用

王 璐,冯 慧,冯成利

(陕西省动物研究所,陕西 西安 710032)

野生动物的非法猎杀、贸易等情况一直存在，而一些缴获的非法贸易动物因为外形遭到破坏，无法从形态上进行准确的鉴定，对于森林公安的执法造成一定的影响。因此通过对动物的皮毛、血液以及肌肉等进行分子检测，得到准确的鉴定结果会对野生动物保护和打击非法经营和走私野生动物活动有着重要的意义[1～3]。同理动物肉制品因为属于一种半加工过的食品，存在着造假、以次充好的现象，常规的检测无法进行有效的鉴定，而DNA水平的检测将会很好地解决这一难题。

细胞色素B(Cyto chrome b, Cytb)基因位于线粒体环状DNA中，是编码线粒体内膜上细胞色素b氧化酶的基因的一个亚基，由线粒体DNA H链所编码。它的起源非常古老，在几乎所有的真核生物和许多原核生物中都有发现，它不但在属间、种间存在多样性，而且在品种间、品种内个体间都存在多样性，因此Cytb基因是研究种间进化关系的最佳基因之一[4～5]。通过对物种Cytb基因的检测对比，可以准确地对其进行鉴别分类。

1 材料和方法

1.1 材料

研究的实例样品分别来自两方面，一方面是陕西省森林公安送检的非法贸易动物肌肉样品，另一方面是从附近的串串店取材的肉质食品。

1.2 方法

1.2.1 总基因组DNA的提取以及PCR扩增 用Promega试剂盒提取样品DNA，提取出来后取5 μL，用1%琼脂糖电泳进行检测，其余-20℃保存。

PCR扩增的目的片段为线粒体DNA细胞色素B基因部分片断序列，大小约460bp，引物选取线粒体DNACytb通用引物进行扩增。

表1 样品信息

(S0609-1189F)Cytb-F 5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3'

(S0609-1189R)Cytb-R 5'-CTCACCTGATATTTGTCCTCA-3

'PCR反应在PTC-200 PCR仪(BIO-RAD)中进行，扩增条件如表2。将PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，-20℃保存。

1.2.2 PCR产物测序 将得到的PCR产物按照96孔纯化板纯化操作后，进行测序。测序反应体系为：2 uL Mix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、H2O)，2 uL纯化后的产物，1 uL引物(5 mmol·L-1)。测试反应程序为：循环条件95℃ 15s，(95℃ 15s 50℃ 5s 60℃ 90s)x35循环，终止反应。

2 结果与分析

2.1 森林公安送检样品

将样品测出来的Cytb基因序列与基因库里的标准序列进行对比，得到的进化树关系图分别如图1、图2、图3。

可以看出样品J1、J2都是与野猪的遗传的距离最为接近，J3与羊的遗传的距离最为接近。再进行一对一的序列比对，发现测出来Cytb基因序列匹配率都在99%以上，因此可以判定森林公安送检的J1、J2是野猪，J3就是普通的山羊。

表2 PCR反应体系及条件

2.2 串串店所提取肉制食品样品

提取的肉质食品样品都是已知的，因此将四个样品分别羊、牛、猪和鸡的标准Cytb基因序列进行比对，结果如表3。经过检测我们发现R1、R2、R3的检测结果表明没有问题，但是R4检测出来并不是鸡肉，而是牛肉。

表3 肉质食品样品Cytb基因序列对比

3 分析讨论

运用细胞色素B基因检测方法对动物肉制食品的的真假鉴定相对简单，一是动物肉制食品都是比较常见的物种，检测范围比较小；另外一个方面我们只需将要检测肉制食品样品与标准Cytb基因序列进行一对一的比对，序列匹配就说明是真的，反之证明是假的。而非法贸易野生动物的Cytb基因序列鉴定则要建立在有一个标准Cytb基因序列库基础上，将未知动物样品带入进行比对，从而得出正确的结果。相对于普通的形态学鉴定，分子鉴定手段在物种鉴定方面更为准确，而且随着生物技术的不断发展，包含细胞色素B基因检测方法在内的DNA鉴定方法也在不断进步，我们坚信在未来DNA分子技术将会在物种鉴定方面发展的更为迅捷、有效，为打击野生动物非法贸易以及食品安全提供有力的技术支撑。