外周血ALDH7A1 mRNA表达水平对乙肝后肝硬化患者Child分级和预后的评估价值

詹有芳，张 珏△，王 鹏

1.上海中医药大学附属曙光医院检验科，上海 200021；2.上海市浦东新区妇幼保健院检验科，上海 201206

肝硬化是我国常见疾病之一，它是由不同病因引起的慢性进行性弥漫性肝病，病理上以肝脏弥漫性纤维化、再生结节和假小叶形成为特征[1-2]。肝硬化患者起病较为隐匿，病程持续较长，发展缓慢[3]，是导致肝移植、肝癌及肝病相关死亡的重要危险因素[4]。由于肝硬化病变较难控制，使患者生存质量和生存时间都受到严重影响。因此，准确评估肝硬化患者的严重程度对监测疾病进展和判断疾病预后有重要参考价值[5]。本研究检测了外周血乙醛脱氢酶(ALDH7A1)家族成员ALDH7A1 mRNA在不同Child分级乙肝后肝硬化患者中的表达水平，分析其与临床生化指标的相关性，进一步考察ALDH7A1对Child分级的诊断识别能力，以及与不同并发症的关系，旨在评估ALDH7A1在乙肝后肝硬化患者疾病进展和预后中的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取乙肝后肝硬化患者90例，其中Child A、B和C级各30例作为乙肝后肝硬化组，参照《病毒性肝炎防治方案》[6]中有关乙肝后肝硬化的诊断标准确诊并分级，其中男60例，女30例，年龄37～62岁，平均(50.05±1.21)岁。乙肝后肝硬化为慢性乙肝发展的结果，肝组织病理学表现为弥漫性肝纤维化及结节形成，二者必须同时具备才能诊断。(1)代偿性肝硬化指早期肝硬化，一般属Child A级，可有轻度乏力、食欲减弱或腹胀症状，尚无明显肝功能衰竭表现。血清清蛋白(ALB)水平降低，但仍≥35 g/L，血清总胆红素(TBIL)≤35 μmol/L，凝血酶原活动度>60%。血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)及天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平轻度升高，AST水平可高于ALT，γ-谷氨酰转移酶水平可轻度升高。可有门静脉高压，如轻度食管静脉曲张，但无腹水、肝性脑病或上消化道出血。(2)失代偿性肝硬化指中、晚期肝硬化，一般属Child B、C级，有明显肝功能异常及失代偿征象，如血清ALB<35 g/L，明显黄疸，血清TBIL>35 μmol/L，ALT和AST水平升高，凝血酶原活动度<60%。患者可出现腹水、肝性脑病及门静脉高压引起的食管、胃底静脉明显曲张或破裂出血。Child评分标准见表1,将所记分数相加，根据总分分为A、B、C级。A级≤6分；B级>6～9分；C级>9分。另选取健康志愿者30例作为健康对照组，其中男20例，女10例，年龄35～60岁，平均(47.63±12.37)岁。两组研究对象性别和年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。所有研究对象均知情同意并签署知情同意书。

表1 Child肝功能分级评分标准

1.2排除标准 合并严重心、胆、肾、内分泌、造血系统及精神神经疾病者；妊娠或哺乳期妇女。

1.3方法 标本及信息收集：采集各研究对象清晨空腹乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝静脉血5 mL，用淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞，采用TRIzol试剂(Thermo，美国，型号：15596026)提取细胞总RNA，-80 ℃保存待测。另抽取各研究对象静脉血5 mL，分离血清，检测ALT、AST、ALB、TBIL、透明质酸(HA)等临床指标水平。同时记录肝硬化患者食管胃底静脉曲张、消化道出血、自发性腹膜炎、脾大等并发症信息。实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测：将总RNA反转录为cDNA，采用qRT-PCR进行扩增，以GAPDH作为内参。ALDH7A1上游引物序列：5′-CAT GGC GTG AGT GAA GGA C-3′，下游引物序列：5′-CAG GGC AAT AGG TCG TAA TAA CC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGG TAT CGT GGA AGG ACT CAT GAC-3′，下游引物序列：5′-ATG CCA GTG AGC TTC CCG TTC AGC-3′。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，然后进行40个循环(94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt表示ALDH7A1 mRNA的相对表达量。

2 结 果

2.1健康对照组和乙肝后肝硬化组不同Child分级患者ALDH7A1 mRNA表达水平比较 见表2。与健康对照组比较，乙肝后肝硬化组不同Child分级的患者ALDH7A1 mRNA表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Child A级组比较，Child B级组和Child C级组ALDH7A1 mRNA表达水平均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Child B级组比较，Child C级组ALDH7A1 mRNA表达水平虽有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 健康对照组和乙肝后肝硬化组不同Child分级的患者ALDH7A1 mRNA表达水平比较

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与Child A级组比较，#P<0.05。

2.2乙肝后肝硬化患者ALDH7A1 mRNA与临床生化指标的相关性分析 乙肝后肝硬化患者ALT水平为(102.51±62.07)U/L，AST水平为(138.70±72.35)U/L，ALB水平为(32.31±15.46)g/L，TBIL水平为(58.18±34.72)μmol/L，HA水平为(218.16±133.98)ng/mL，Child得分为(8.57±4.32)分。ALDH7A1 mRNA表达水平与肝损伤指标ALT、AST呈负相关(r=-0.57、-0.59，P<0.05)，与肝脏生物合成能力指标ALB呈正相关(r=0.37，P<0.05)，与肝脏解毒能力指标TBIL呈负相关(r=-0.72，P<0.05)，与纤维化指标HA呈负相关(r=-0.64，P<0.05)，与Child得分呈负相关(r=-0.539，P<0.05)。

2.3ALDH7A1 mRNA在不同Child分级的乙肝后肝硬化患者中ROC曲线分析 为衡量ALDH7A1 mRNA对不同Child分级的乙肝后肝硬化患者的诊断识别能力，对相邻Child分级之间进行ROC曲线分析见图1，即Child A级组和Child B级组及Child B级组和Child C级组之间比较。ALDH7A1 mRNA对Child A级和Child B级的识别能力较强，ROC曲线下面积(AUC)为0.859，而对Child B级和Child C级的识别能力较弱，AUC仅为0.681。

注：A为Child A级和Child B级比较；B为Child B级和Child C级比较。

图1乙肝后肝硬化患者不同Child分级间ROC曲线分析

2.4乙肝后肝硬化患者有无并发症时ALDH7A1 mRNA表达水平比较 见图2。90例乙肝后肝硬化患者中出现食管胃底静脉曲张58例，消化道出血48例，自发性腹膜炎29例，脾大33例，与无并发症肝硬化患者比较，有并发症患者ALDH7A1 mRNA表达水平均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图2 乙肝后肝硬化患者有无并发症时ALDH7A1 mRNA表达水平比较

3 讨 论

肝硬化是一种严重的肝脏疾病，该类患者的疾病进展监控和预后判断一直是临床研究的重要课题。早期肝硬化患者症状不甚明显，发展至后期则会出现肝功能衰竭、肝酶水平逐渐升高、门静脉高压等症状，甚至出现出血倾向[7]。另一方面，肝硬化患者5年生存率高达85%以上，但发生腹水、肝肾综合征、肝性脑病等不良事件后会导致患者病情快速恶化，大幅度降低患者5年生存率[8]。因此，对肝硬化患者进行早期诊断和改善预后是目前急需解决的问题。

ALDH7A1是乙醛脱氢酶家族成员之一[9]，乙醛脱氢酶家族与生物氧化关系密切，是线粒体内重要的醛类氧化酶，能够氧化多种有害的芳香醛和脂肪醛，防止其对细胞膜的脂质过氧化，是机体重要的保护因子之一[10]。脂质过氧化反应在Kuffer细胞和Ito细胞的激活及其胶原基因的表达，以及肝纤维化、肝硬化的形成过程中起重要作用，脂质过氧化反应可能是连接组织损伤、肝纤维化及肝硬化的纽带[11]。有研究显示，ALDH7A1能够缓解乙醛等醛类和氧化应激导致的细胞毒性[12]。还有学者发现，ALDH7A1在药物诱导的肝脂质变性中呈时间/剂量依赖性增加[13]。

本研究采用qRT-PCR检测不同Child分级的乙肝后肝硬化患者外周血ALDH7A1 mRNA表达水平发现，随着Child分级增加，ALDH7A1 mRNA表达水平逐渐下降，且ALDH7A1表达水平与肝损伤程度、肝生物合成能力、肝解毒能力、肝纤维化程度等多项临床指标具有相关性。进一步分析发现，ALDH7A1 mRNA表达水平对乙肝后肝硬化早期的Child A级和Child B级识别能力较强，具有一定的早期诊断价值。同时，ALDH7A1 mRNA低表达患者预后较差，可能出现食管胃底静脉曲张、消化道出血、自发性腹膜炎、脾大等多种并发症，说明ALDH7A1对乙肝后肝硬化的预后也具有一定指导意义。

综上所述，ALDH7A1可能是乙肝后肝硬化疾病进展监控和预后判断的一项潜在生物标志物，在临床上具有重要参考价值。