维生素D检测与慢性肾脏病研究进展*

李园梦 综述，俸家富，2△ 审校

1.西南医科大学附属医院医学检验部，四川泸州 646000；2.绵阳市中心医院检验科，四川绵阳 621000

维生素D(VitD)是一组亲脂性甾体类固醇衍生物的统称，其亚组分很多，但与人体健康相关的主要是VitD2和VitD3，其中VitD2主要来源于植物性膳食，而VitD3主要通过光照经皮肤合成，少数来源于动物性膳食[1]。最近研究发现，VitD除了与骨骼疾病[2-4]、血脂紊乱[5]和自身免疫性疾病[6]等有关外，还发现其缺乏或不足与慢性肾脏病(CKD)的发生和发展密切相关[7]。CKD是临床上多见的一种慢性疾病，因其发病率较高而知晓率较低，已成为全球一大公共卫生问题。越来越多的研究发现，VitD缺乏或不足可能与CKD发病、病情严重程度及预后有关，特别是在晚期CKD患者和肾移植患者中，对VitD的依赖表现更加明显[8-10]。本文就VitD缺乏与CKD的关系综述如下。

1 VitD的生理功能与流行病学

VitD本身并无生物活性，只有在肝脏和肾脏中分别经碳25号位和碳1号位上的2次连续羟基化生成1,25(OH)2D后，才能成为有生化功能的活性物质。1,25(OH)2D的生理功能包括：通过内分泌功能调节骨骼和矿物质代谢；抑制细胞增殖、肾素生成和血管生成；促进细胞终末分化、胰岛素生成和巨噬细胞抗菌肽生成；调节免疫系统(抑制适应性免疫但促进先天性免疫的调节)等[11]。1,25(OH)2D在小肠、肾脏和骨组织中的一系列正常生理生化代谢活动受钙(Ca)、磷(P)、甲状旁腺激素(PTH)及成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)等物质调节。在小肠中，1,25(OH)2D3与肠黏膜细胞受体相结合形成复合物，进入核染色体，促进信使核糖核酸合成，并让相关基因在细胞质内表达转化为钙结合蛋白，从而增强小肠对Ca的吸收[12]。当1,25(OH)2D3水平降低时，小肠Ca、P吸收减少，血Ca循环水平较低，促进了PTH水平反应性升高，并将其释放至肾脏及骨组织器官中[12]。在肾脏中，PTH通过抑制肾小管上皮细胞增殖，促进氢氧化酶(也称1α-羟化酶)基因表达，同时抑制24-羟化酶活性，以增强1,25(OH)2D3产生，进而增强肾小管对Ca的重吸收能力[12]。在骨组织中，PTH还可与1,25(OH)2D3共同作用，从骨细胞中动员Ca，并将其释放到血液中，从而使低血Ca恢复到正常水平[12]。相反，当血清1,25(OH)2D3水平升高时，血Ca循环水平较高，促使PTH水平反应性降低，从而通过负反馈调节进一步抑制1,25(OH)2D3产生。

众所周知，VitD是人体内必需的营养素。有研究表明，VitD缺乏或不足现象日益严重，其逐渐成为全球公认的公共卫生问题[13]。我国一些研究发现，柳州市城区1～3岁儿童VitD缺乏和不足率达12.94%，4～6岁儿童VitD缺乏和不足率达39.81%[14]。丽水市区22～38岁孕妇血清25(OH)D缺乏率为54.20%，严重缺乏率为35.70%[15]。广州市区夏季(5～10月)40岁以上人群中，男性VitD严重缺乏、缺乏和不足分别占7.56%、33.19%和34.45%；女性VitD严重缺乏、缺乏和不足分别占6.53%、40.63%和37.22%[16]。银川地区中老年体检者血清VitD缺乏和不足达到81.03%[17]。由此可见，我国VitD缺乏或不足涉及的人群十分广泛，从新生儿到中老年人等各年龄段均可出现，由此提示临床医生应关注和重视患者的VitD营养状况，特别是VitD缺乏的高风险群体。

2 VitD检测

2.1VitD的认识 通常所说的VitD是一个通用术语，其既不考虑VitD代谢物之间的结构和功能差异，也不代表某种具体VitD简写形式或羟化结构式。只有当使用25(OH)D、25(OH)D2、25(OH)D3或1,25(OH)2D这些缩略式时，才是特指VitD的某种特定羟化结构形式。因此，通常所说的VitD检测是指检测其某种具体结构形式[如25(OH)D或1,25(OH)2D]或某些结构形式的组成成分[如25(OH)D2、25(OH)D3]及这些成分之和，而具体是检测哪种羟化结构形式，取决于其采用的是何种检测方法，不同VitD比较见表1。

2.2VitD检测方法 关于VitD的检测，目前国内外临床实验室常用方法主要有两大类，一类是免疫分析法，目前应用最多的是酶联免疫吸附试验(ELISA)和化学发光分析法(CLIA)，后者包括电化学发光分析法(ECLIA)，此外，放射免疫法(RIA)和免疫比浊法(即全自动生化法)也有部分应用[18]；另一类是色谱法，目前临床实验室应用较多的主要包括：高效液相色谱分析法和液相色谱-串联质谱分析法(LC-MS/MS)。

表1 不同VitD比较

2.2.1免疫分析法特点 RIA使用的试剂对实验操作人员和环境具有潜在的放射性污染风险，并且其放射性废物处理过程复杂繁琐；ELISA中酶促反应与反应温度、孵育时间、加样是否准确和洗板是否干净等因素有关，此外，其灵敏度和特异度不理想，且易有基质效应干扰或与其他非目标羟基化合物发生交叉反应；CLIA、ECLIA和全自动生化法具有全自动和高通量的优点。由于VitD结合蛋白(DBP)与VitD代谢物中间产物[如25(OH)D、1,25(OH)2D和24,25(OH)2D等]结合的亲和力不同，导致DBP释放效率有所差异、非等效检出25(OH)D2或25(OH)D3、C3-epi-25(OH)D3[与25(OH)D3具有相同结构但在立体化学构型上不同的分子]对VitD代谢物中间产物的交叉反应性、异嗜性抗体的干扰或者缺乏国际测定标准等因素导致各种免疫分析方法间的检测结果变异太大[19]。免疫分析法共有的缺点是只能检测总25(OH)D水平，无法单独检测25(OH)D2和25(OH)D3水平和相对比例，比如罗氏诊断只能检测25(OH)D3水平。

2.2.2色谱法特点 色谱法与传统免疫分析法相比不同的是：LC-MS/MS定量分析法是国际上公认的测量25(OH)D的金标准，它可通过特定的相对分子质量和质量碎片区分25(OH)D2和25(OH)D3和其他类似代谢化合物，以同时检测其血清25(OH)D2和25(OH)D3水平，该法抗干扰能力强，且灵敏度、特异度、准确性和重现性均很好，但通量低(标本前处理耗人工和时间)、仪器昂贵，且需要专业操作人员，这在一定程度上限制了它的使用。由于市面上供应的VitD补充剂包括植物来源的VitD2和动物来源的VitD3，因此，为了保证两种来源的VitD补充剂水平均能被准确检测出，国际上推荐应该同时检测25(OH)D2和25(OH)D3[20]，这就意味着临床VitD检测应该首选LC-MS/MS，且要求该方法能够区分25(OH)D的C3-差向异构体(可通过调整反相色谱柱，延长运行时间来解析C3-差向异构体)，以消除C3-差向异构体对25(OH)D2和25(OH)D3的干扰，从而避免对25(OH)D的高估。

2.3血液循环结合VitD、游离VitD及生物可利用VitD解读 上述检测方法主要用来检测总25(OH)D、25(OH)D2、25(OH)D3和1,25(OH)2D水平，其在血液循环中还可进一步细分为结合和游离2个部分，其中有85%～90%的25(OH)D/1,25(OH)2D主要与DBP结合，此外还有10%～15%的25(OH)D/1,25(OH)2D与清蛋白(ALB)结合，而游离VitD(即与DBP和ALB均不结合的循环VitD)仅占很小一部分，不到1%[游离25(OH)D约占0.03%，游离1,25(OH)2D约占0.40%]。生物可利用VitD(BAVD)是由游离25(OH)D和25(OH)D与ALB结合2个部分共同组成，因为与ALB结合的部分易发生解离，使其可穿过细胞膜。因此，BAVD可进入细胞以进一步产生具有内分泌或旁分泌作用的活性代谢产物1,25(OH)2D。

根据以上内容可间接估算出游离25(OH)D水平：游离25(OH)D=[25(OH)D2+25(OH)D3]×0.03%。此外，游离25(OH)D水平也可以采用商业化的ELISA试剂盒或LC-MS/MS方法直接测得。早期游离25(OH)D水平是使用来自Bikle DD的公式[21]间接估算可得：游离25(OH)D=总25(OH)D/(1+KaALB×CALB+KaDBP×CDBP)，其中KaALB和KaDBP代表各自的亲和常数，CALB和CDBP代表各自的水平，采用此公式计算有一个前提是Ka不变。游离1,25(OH)2D水平也可使用此公式计算。当知晓游离25(OH)D水平后，BAVD可以通过以下公式计算得出：BAVD=(KaALB×CALB×1)-游离25(OH)D[22]。

2.4VitD参考范围 25(OH)D是人体循环VitD水平的主要储存形式，约占总VitD的95%及以上，因其半衰期长，达14～21 d，且不受循环系统中血Ca和PTH水平影响，因此其被公认为是评价受试者VitD营养状况最客观的指标。美国医学研究所(IOM)[23]和美国内分泌学会临床应用指南(EnS)[11]制定的一般人群和高风险人群VitD的参考范围见表2，需注意表中VitD特指血清25(OH)D水平，即25(OH)D2与25(OH)D3之和。

表2 血清VitD的参考范围

注：1 ng/mL=2.5 nmol/L。

3 VitD与CKD

3.1CKD患者常见原发疾病及并发症 CKD的临床特征是患者肾功能逐渐丧失，表现为肾结构和肾功能的不可逆性改变。引起CKD发生的常见原发疾病主要包括：糖尿病肾病、高血压肾病、微小病变和慢性肾小球肾炎等。这类患者随着肾脏功能下降，可导致继发性甲状旁腺功能亢进、心血管疾病、矿物质和/或骨代谢紊乱等并发症。

3.2CKD患者VitD水平 国内外许多临床研究表明，CKD患者可能是VitD缺乏或不足的高危人群：我国南方FENG等[9]和FENG等[10]的观察性研究结果显示，1～2期CKD患者VitD不足和缺乏可达92.3%，其中52.5%的患者为VitD不足，39.8%的患者为VitD缺乏；3～5期透析前CKD患者VitD不足和缺乏高达96.7%，其中57.2%的患者为VitD不足，39.5%的患者为VitD缺乏；并且还发现4期和5期CKD患者血清25(OH)D水平低于3期CKD患者。新加坡3～5期透析前CKD患者VitD不足和缺乏可达86.8%，其中57.7%的患者为VitD不足，29.1%的患者为VitD缺乏[24]。尼泊尔成人肾移植受者中VitD不足和缺乏可达72.6%，其中53.8%的患者为VitD不足，18.8%的患者为VitD缺乏[25]。韩国1～5期透析前CKD患者VitD缺乏的患病率为70.2%[26]。意大利CKD儿童患者25(OH)D缺乏的患病率为32.0%，其中5期CKD透析患者占51%[8]。由此可见，低血清25(OH)D水平在CKD患者中极为常见。

3.3影响CKD患者VitD水平的因素 在CKD患者中，由于肾功能障碍导致VitD代谢失调，使VitD、Ca、P、PTH和FGF-23之间的相互作用被破坏，最终导致1,25(OH)2D循环水平降低,其可能原因有：日晒不足，导致通过光照经皮肤合成的1,25(OH)2D减少；皮肤色素沉着过度及限制进食富含VitD食物等因素，减少了1,25(OH)2D的内源性合成；肾小球滤过率逐渐降低限制了底物25(OH)D向1α-羟化酶的递送，从而减少了1,25(OH)2D的产生；VitD受体水平降低；内吞性受体巨蛋白减少使25(OH)D-DBP复合物重吸收至近端肾小管受阻，导致25(OH)D-DBP复合物在尿中排泄增加，使底物25(OH)D相对减少，最终导致1，25(OH)2D生成减少；尿中DBP的排泄丢失；有效肾单位减少限制了肾近端管状细胞中1α-羟化酶的数量；肾功能下降导致的磷酸盐持续保留和FGF-23水平增加；增加的FGF-23直接抑制CYP27B1和促进CYP24A1酶活性，使1,25(OH)2D合成减少。

有研究表明，影响CKD患者VitD缺乏的危险因素有：低碱性磷酸酶、高清蛋白、高总胆固醇[27]和高全段甲状旁腺激素水平等[25]。然而，VitD缺乏与肾小球滤过功能间的关系尚存争议。据报道，3～5期透析前CKD患者血清25(OH)D水平随着估计肾小球滤过率(eGFR)降低而下降[10]。然而，也有研究认为，血清25(OH)D水平随eGFR下降而增加，甚至有研究认为25(OH)D和/或1,25(OH)2D水平与eGFR无关[25,28]。还有研究发现，eGFR下降与VitD缺乏呈正相关，但该学者经过对基线eGFR进行校正后发现，eGFR下降与VitD缺乏无关，因此认为基线eGFR水平可能混淆了25(OH)D与eGFR的关系[29]。

3.4VitD及其类似物的肾脏保护作用 CKD的标志是蛋白尿、肾小球硬化和肾小管间质纤维化。同时，肾脏也是VitD代谢的靶器官。除了经典的Ca和P调节外，VitD也是细胞炎性反应、细胞增殖分化和细胞凋亡的重要调节因子。VitD及其类似物主要通过减少蛋白尿排泄(抑制足细胞损伤)、抑制肾小球硬化(抑制细胞增殖和阻滞细胞周期)、抑制肾小管间质纤维化、抑制炎性反应和阻滞肾素-血管紧张素系统激活，以此防止或减轻肾损伤，从而延缓CKD病情进展，实现对肾脏的潜在保护作用。

综上所述，VitD缺乏不仅在人群中广泛存在，而且也是导致肾功能损伤，促进CKD患者疾病发展和高致死率的危险因素。因此，血清VitD亚组分的检测作为CKD发生和发展潜在的生物标志物，可能对CKD早期诊断、疗效监测和预后评估等有重要临床意义。