喹硫平减轻精神分裂症小鼠脑内胶质细胞增生研究☆

邵园 王建 朱俊 毕建强 冯飞 许海云

近年有研究提出精神分裂症患者脑内存在星形胶质细胞和小胶质细胞增生激活[1-2]。喹硫平（quetiapine,QTP）是临床常用抗精神病药。既往认为QTP通过阻断多巴胺受体治疗精神分裂症。最近有研究发现，喹硫平可减轻小鼠脑内胶质细胞增生[3]。但是，喹硫平治疗精神分裂症的机制是否有减轻胶质细胞增生的作用发挥其中，目前尚不清楚。铜腙（cuprizone,CPZ）暴露1周的小鼠表现出精神分裂症样行为，同时还产生脑内星形胶质细胞、白介素（interleukin-6,IL-6）激活等反应，可作为精神分裂症的动物模型之一[4-5]。本研究应用CPZ暴露1周小鼠作为精神分裂症动物模型，研究QTP对小鼠脑内星形胶质细胞和小胶质细胞的作用，为精神分裂症的治疗提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及分组SPF级成年健康雄性6周龄C57BL/6小鼠48只，由广东省实验动物中心提供。实验前在汕头大学医学院实验动物中心适应1周。之后小鼠随机分成QTP+CPZ组、生理盐水（normal saline,NS）+CPZ 组、QTP 组、NS组等 4组。实验时每只小鼠腹腔注射QTP（10 mg/kg/d，加拿大 AstraZeneca 公司）或 NS（1 mL/100 g），连续2周。实验第1周时，所有小鼠均喂食普通饲料。第2周时，小鼠喂食含CPZ（0.2%，w/w，美国Sigma公司）的饲料或普通饲料。QTP、CPZ、NS的剂量根据参考文献及前期研究[6]。实验动物的操作和处理过程均遵守汕头大学医学院饲养和使用实验动物的相关规定。

1.2 旷场实验应用Noldus动物行为视频跟踪分析系统检测，观察箱长×宽×高=50 cm×50 cm×35 cm。通过摄像系统记录小鼠在10 min内的自发活动。由计算机分析小鼠10 min内的总路程、中央路程。

1.3 免疫荧光检测GFAP、Iba-1表达用免疫荧光标记的anti-胶质纤维样酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein,GFAP）抗体检测星形胶质细胞的变化，用免疫荧光标记anti-钙离子连接蛋白分子-1（calcium bingding adaptor molecule-1,Iba-1）抗体检测小胶质细胞的变化。行为学实验结束后第2天，所有小鼠灌注取脑，冰冻后25 μm连续切片，脱水、固定、4℃保存。切片取出，PBS洗5 min×3次；30% H2O2和甲醇按1:50混合，室温静置30 min，PBS 洗5 min×3 次；0.1%TritonX-100 浸泡，4℃ 10 min，PBS洗 5 min×3次； 山羊血清工作液浸泡30 min；一抗孵育（兔抗GFAP多克隆抗体，英国Abacam公司；兔抗Iba-1多克隆抗体，日本wako公司），空白对照加PBS，4℃过夜；室温复温 1 h，PBS 洗5 min×3次；加 HRP标记的二抗，37℃孵育 30 min，PBS洗 5 min×3次；DAB 显色 3～5 min，PBS洗片；贴片，常规脱水、透明、封片。用荧光倒置显微镜拍照，采用Image-Pro Plus(IPP)6.0软件分析免疫荧光图片，分析GFAP和Iba-1阳性细胞的积分光密度 （integrated option density,IOD）值。

既往结果显示，小鼠脑内胶质细胞增生主要集中在皮质（cortex,CTX）及海马 CA1区[7]，另外，CPZ选择性损伤脑白质，多集中在胼胝体（corpus callosum,CC）[8]，因此本研究观察 CC、CTX、CA1 区GFAP和Iba-1阳性细胞IOD值。

1.4 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计分析。数据采用双因素（QTP用药和CPZ建模两个因素）方差分析主效应和交互效应，用Fisher′s LSD法进行两两比较。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 小鼠自发活动对于旷场实验总路程，双因素方差分析显示 QTP（F=22.88，P＜0.01）和 CPZ（F=7.19，P=0.01）主效应均有统计学意义，两因素之间没有交互作用 （F=2.11，P=0.16）。两两比较显示，QTP+CPZ组比 NS+CPZ组总路程减少 （P＜0.01），NS+CPZ组小鼠总路程比 NS组增多 （P＜0.01），差异有统计学意义。见表1。

对于中央路程，QTP主效应（F=1.36，P=0.26）、CPZ 主效应（F=0.29，P=0.59）以及两者交互作用（F=3.99，P=0.06）均无统计学意义。对于中央路程/总路程，QTP 主效应 （F=0.34，P=0.57）、CPZ主效应（F=0.04，P=0.84）以及交互作用（F=2.42，P=0.14）均无统计学意义。见表1。

表1 喹硫平和铜腙对小鼠自发活动的影响

2.2 小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞激活对于GFAP阳性细胞，在CC区，QTP与CPZ交互作用无统计学意义（F=3.97，P=0.06），QTP 主效应（F=6.58，P=0.02）和 CPZ 主效应（F=46.84，P＜0.01）有统计学意义。两两比较显示，QTP+CPZ组与NS+CPZ组相比 （P=0.04），NS+CPZ组与 NS组相比（P＜0.01），差异有统计学意义。在CTX，交互作用（F=9.09，P=0.01）、QTP 主效应（F=7.48，P=0.01）和 CPZ 主效应（F=21.94，P＜0.01）均有统计学意义。在 CA1 区，交互作用（F=7.88，P=0.01）、QTP 主效应（F=11.01，P＜0.01）和 CPZ 主效应（F=29.76，P＜0.01）均有统计学意义。两两比较，在CTX和CA1区均显示，QTP+CPZ组与NS+CPZ组相比（P＜0.01），NS+CPZ 组与 NS 组相比（P＜0.01），差异有统计学意义。见图1及表2。

表2 喹硫平和铜腙对小鼠脑内GFAP阳性细胞 IOD值的影响

图1 各组小鼠脑内GFAP阳性细胞表达（100×）A为CC区，B为CTX区，C为CA1区。免疫荧光。

对于Iba-1阳性细胞，在CC区，两因素交互作用（F=29.97，P＜0.01）、QTP 主效应（F=23.83，P＜0.01）和 CPZ 主效应（F=140.88，P＜0.01）均有统计学意义。在 CTX区，交互作用（F=9.02，P=0.01）、QTP 主效应（F=9.02，P=0.01）及 CPZ 主效应（F=43.45，P＜0.01）均有统计学意义。在 CA1区，交互作用（F=20.00，P＜0.01）、QTP 主效应（F=21.23，P＜0.01）和 CPZ 主效应（F=111.42，P＜0.01）均有统计学意义。两两比较显示，在CC、CTX、CA1区，QTP+CPZ 组比 NS+CPZ 组减少（P＜0.01），NS+CPZ 组比NS组增加（P＜0.01）。见图 2及表 3。

图2 各组小鼠脑内Iba-1阳性细胞表达（100×） A为CC区，B为CTX区，C为CA1区。免疫荧光。

表3 喹硫平和铜腙对小鼠脑内Iba-1阳性细胞IOD值的影响

3 讨论

本研究发现，CPZ暴露1周增加C57BL/6小鼠的自发活动，同时小鼠脑内胶质细胞增生明显。并发现喹硫平能改善小鼠的行为学改变，具有减轻CPZ诱导胶质细胞增生的作用。这提示喹硫平减轻脑内胶质细胞增生可能是其受体外的作用机制之一，为精神分裂症治疗带来了新的靶点和理论依据，具有重要意义。

本研究旷场实验结果显示，小鼠经CPZ暴露1周后总路程增加，提示小鼠自发活动增多。既往也有研究表明，CPZ暴露的小鼠可能存在中枢神经系统多巴胺系统激活[9]。但是TEZUKA等[4]研究显示CPZ暴露1周的C57BL/6小鼠自发活动无明显变化。两项研究实验方法仅敞箱大小及实验时间不同：TEZUKA等[4]研究中敞箱大小为45.5 cm×25 cm×35 cm，实验时间5 min；本研究的敞箱大小为50 cm×50 cm×35 cm，实验时间10 min。这可能是实验结果不一致的原因，但需要进一步研究验证。不过这提示CPZ暴露小鼠其自发活动具有动态变化的特征，这与精神分裂症患者的症状复杂性一致，有的患者表现易激惹、活动多，有的却表现淡漠、懒语少动[10]。QTP+CPZ组与NS+CPZ组小鼠相比，自发活动减少，提示QTP可以缓解CPZ诱导的自发活动增多。

本研究还显示，CPZ暴露1周引起小鼠脑内CC、CTX、海马CA1区的星形胶质细胞和小胶质细胞增生，这与TEZUKA等[4]的研究结果一致。也有其他研究表明CPZ暴露引起神经胶质细胞的激活[11]。更重要的是，本研究发现，喹硫平在减轻CPZ诱导小鼠脑内胶质细胞增生的同时，还改善了CPZ诱导的自发活动增多。既往研究表明，喹硫平通过促进星形胶质细胞释放脑源性神经营养因子来预防Aβ 25-35诱导的神经元细胞死亡[12]，因此推测，QTP具有减轻脑内胶质细胞增生作用，可能通过此作用改善CPZ暴露小鼠的异常行为。但是本研究尚不能明确其因果关系，后续研究将对其进一步验证、完善。

需要指出的是，脑内星形胶质细胞和小胶质细胞功能复杂，参与炎症反应等很多过程。既往有研究表明，CPZ模型小鼠脑内星形胶质细胞增生激活，并释放大量IL-6、IL-1β等炎症因子[13]。小胶质细胞释放的炎症因子在多发性硬化[14]、精神分裂症[4]等疾病中具有重要意义。可见，星形胶质细胞和小胶质细胞激活在一定程度上可反映神经炎症反应，但不能完全等同。遗憾的是，本研究未进行脑内相关炎症因子的检测。后续将对此进行深入研究，进一步验证精神分裂症胶质细胞增生与免疫炎症假说之间的关联。

本研究没有进一步探讨QTP减轻脑内胶质细胞增生的作用机制，但是QTP的药理作用和本课题组既往研究[15]可以提供一些线索。QTP通过抑制核因子-κB （nucleus factor kappa B,NF-κB）途径减弱APP/PS1转基因小鼠的神经胶质细胞激活和促炎细胞因子升高[16]。另一个可能的作用机制是，QTP通过抗氧化作用发挥减轻胶质细胞增生的作用。有研究表明，小鼠脑内胶质细胞增生与氧化应激反应有密切的关联[17]。本课题组既往研究也发现，CPZ暴露使脑内抗氧化物酶活性下降，表明出现氧化应激反应[15]。本研究小鼠经同样处理后表现出脑内胶质细胞增生。可认为CPZ暴露的小鼠线粒体氧化应激和胶质细胞增生可能存在因果关系。既往也有研究表明氧化应激可以激活氧化还原反应及NF-κB，而NF-κB可促进胶质细胞增加炎症介质的表达[18]。因此推测，QTP可能通过抗氧化作用改善CPZ短期暴露所致的胶质细胞增生。

QTP减轻胶质细胞增生的作用为精神分裂症治疗提供了新方向，对精神疾病研究具有重要意义。后续研究将观察脑内胶质细胞增生与精神分裂症的关联，以及喹硫平减轻胶质细胞增生的作用机制，为精神疾病临床治疗提供更全面的帮助。