麦角甾苷促进大鼠骨折愈合及对骨形态发生蛋白/Runx2 通路的影响

徐亚平，刘岳勇，李 浩，双 峰，杨淮河

（中国人民解放军联勤保障部队第九〇八医院骨科脊柱病区，江西 南昌 330000）

骨折为常见的骨科疾病之一，虽然化学药物[如甲状旁腺素（PTH 1-34）、降钙素等]在治疗骨折方面取得了一定的成效，但由于有一定的毒副作用（如PTH 1-34会增加大鼠发生骨肉瘤的风险），不合适长期使用[1-2]。中医药治疗骨折毒副作用小、疗效好，适合骨折患者长期使用。肉苁蓉是一种寄生在沙漠树木梭梭根部的寄生植物，麦角甾苷为其主要活性成分[3]。根据中医“肾藏精，主骨，生髓”的理论，肉苁蓉具有促进骨愈合、防治骨科疾病的功效，但其在骨科疾病方面的应用研究较少[4]。成骨细胞功能在调节骨代谢中有重要作用，其功能缺乏可能导致骨形成的负面影响，延缓骨折愈合的进程[5]。BMP-2 蛋白在促进成骨细胞分化和成熟方面具有重要作用，可通过调控骨形态发生蛋白（BMP） /Runx2 通路促进骨折愈合[6]。本研究中探讨了麦角甾苷通过调控BMP/Runx2 通路促进骨折愈合，为其临床应用提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

SD 大鼠（中国食品药品检定研究院，合格证号SCXK ＜京＞2014-0013）。麦角甾苷（中国食品药品检定研究院，批号为190217）；复方骨肽注射液（江西康缘桔都药业有限公司，批号为19012503）；10%水合氯醛（上海上药新亚药业有限公司，批号为190106）。碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；骨Gla 蛋白（BGP）酶联免疫吸附（ELISA）法试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；TRIzol（天根生化科技有限公司）；RNA 反转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒（大连TaKaRa 公司）。BMP，骨形态发生蛋白受体瘤基因（BMPRIB），骨形态发生蛋白受体（BMPR）Ⅱ，Runx2 和β-actin PCR 引物序列（上海生工生物工程有限公司）：BMP 上 游 引 物5′-GGGACCCGCTGTCTTCTAGT-3′，下 游 引 物5′-TCAACTCAAATTCGCTGAGGAC-3′ ；BMPRIB 上游引物5′-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3′，下 游 引 物5′-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3′；BMPRⅡ上游引物5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′，下游引物5′-GAGGAGCCT GTGGAGAAA TAC-3′；Runx2 上游引物5′-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3′，下 游 引 物5′-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3′ ；β-actin 上 游 引 物5′-CGTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游引物5′-GCATTTGCGGTGGACGA-3′。INSTRON3382 型生物力学实验机（美国英斯特朗公司）；AU5800 型全自动生化分析仪（美国贝克曼公司）；HBS-1096B 型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；NanoDrop2000c 型蛋白核酸检测仪（美国Thermo 公司）；BIO-RADCFX96 型实时荧光定量PCR 仪（美国BD 公司）。

1.2 动物分组及造模

选取雄性SD 大鼠72 只，体质量180 ～220 g，适应性喂养1 周后进行实验，动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求。按随机数字表法将大鼠均分为对照组（A 组）、模型组（B 组）、阳性组（C组）和麦角甾苷低、中、高剂量组（D1，D2，D3组）。用10%水合氯醛麻醉大鼠，切开右侧膝关节下皮肤，显露胫骨。B 组、C 组和麦角甾苷组大鼠在膝关节下约1 cm 处用金属锯子锯断胫骨，进行骨折断端复位，用1.0 mm 克氏针进行髓内固定，用生理盐水清洗伤口，逐层关闭伤口，A 组只暴露胫骨不锯断。术后连续3 d 肌肉注射8万U 青霉素预防感染，待大鼠苏醒后回笼。大鼠苏醒后，C 组腹腔注射复方骨肽（5 mg/kg），D1，D2，D3组分别腹腔注射麦角甾苷（20，40，80 mg/kg），A 组和B 组腹腔注射等量生理盐水。术后4 周、8 周从各组大鼠中随机取6 只，进行麻醉后腹主动脉取血，分离血清，-80 ℃保存备用。分离右侧胫骨，进行X 线摄片及骨生物力学检测，分离骨痂组织，-80 ℃保存备用。

1.3 观察指标

X 线摄片和骨生物力学：采用X 线摄像仪照相，观察大鼠胫骨骨折愈合情况；采用生物力学实验机对股骨进行最大荷载（骨折应力）测试和骨结构强度测试（骨压碎力）的骨生物力学测量。

血清中ALP 和BGP 含量：采用全自动生化分析仪检测血清中ALP 的含量，采用ELISA 法试剂盒检测血清中BGP 含量，操作按试剂说明书进行。

骨痂组织中BMP，BMPRIB，BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表达水平：取冻存的骨痂组织，加入1 mL TRIzol 后进行总RNA 提取，根据RNA 反转录试剂盒说明合成cDNA，再根据荧光定量PCR 试剂盒说明，制备20 μL反应体系进行扩增。扩增条件为95 ℃30 s 预变性、95 ℃5 s 变性、60 ℃44 s，40 个循环，61 ℃时采集荧光，以β-actin 作为内参，采用2-△△Ct法计算。

图1 各组大鼠骨折愈合情况

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件分析。数据以均数±标准差（）表示，用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 X 线摄片结果

结果见图1。给药4 周后，C 组和D2组、D3组大鼠骨折线完全消失，骨痂减少，但髓腔未通；B 组和D1组骨折线模糊，外骨痂存在。给药8 周后，C 组和麦角甾苷各剂量组完全愈合、髓腔再通，B 组骨折线消失，骨痂减少，但髓腔未通。

2.2 骨折应力和骨折碎力

结果见表1。给药4 周后，与A 组相比，其余各组大鼠骨折应力和骨折碎力均明显下降（P ＜0.05）；与B 组相比，C 组和麦角甾苷各剂量组大鼠骨折应力和骨折碎力均明显上升（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性。给药8 周后，与A 组相比，B 组大鼠骨折应力和骨折碎力均明显上升（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性，C 组和麦角甾苷各剂量组大鼠骨折应力和骨折碎力恢复至正常。

表1 各组大鼠骨折应力和骨折碎力的比较（±s，kg）

表1 各组大鼠骨折应力和骨折碎力的比较（±s，kg）

注：与A 组比较，a P ＜0.05；与B 组比较，b P ＜0.05；与C 组比较，c P ＜0.05；与D1 组比 较，d P ＜0.05；与D2 组比较，e P ＜0.05。下表同。

骨折应力 骨折碎力A 组B 组C 组D1 组D2 组D3 组4 周12.04±3.79 4.61±1.25a 7.06±1.41ab 5.04±0.46abc 5.73±0.70abcd 6.89±1.05abde 8 周13.42±3.26 8.78±1.05a 12.68±2.31 9.66±0.915abc 10.82±1.35bcd 12.73±3.675abde 4 周10.38±2.21 7.35±1.67a 9.94±1.78ab 7.80±0.615abc 8.77±0.12bcd 9.56±1.90ab 8 周11.16±2.90 9.42±2.55a 10.86±1.68b 9.82±0.36bc 10.31±0.91bcd 10.82±3.425bde组别

表2 各组血清ALP 和BGP 含量比较（±s）

表2 各组血清ALP 和BGP 含量比较（±s）

A 组B 组C 组D1 组D2 组D3 组4 周149.09±12.50 170.26±20.13a 312.64±19.41ab 203.73±31.73abc 251.90±18.56abcd 315.47±18.46abde 8 周133.72±9.68 149.86±15.05a 163.71±22.42a 154.78±10.72abc 153.16±16.52abcd 162.83±12.84abde 4 周4.49±0.97 8.64±1.68a 15.20±3.42ab 9.28±1.04abc 13.41±2.68abcd 15.64±1.90abde 8 周4.85±0.90 5.93±0.67ab 11.02±0.99ab 6.82±0.39abc 8.25±1.53abcd 11.45±1.30abde ALP（U/L） BGP（ng/mL）组别

2.3 血清ALP 和BGP 含量

结果见表2。给药4 周后，与A 组相比，其余各组大鼠血清ALP 和BGP 含量均明显升高（P ＜0.05）；与B 组相比，C 组和麦角甾苷各剂量组血清ALP 和BGP 含量均明显上升（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性。给药8 周后，B 组、C 组和麦角甾苷各剂量组大鼠血清ALP 和BGP 含量均明显下降（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性，但C 组和麦角甾苷各剂量组血清ALP 和BGP 含量仍高于B 组（P ＜0.05）。

2.4 骨痂组织BMP 和BMPRIB mRNA 表达水平

结果见表3。给药4 周后，与A 组相比，其余各组大鼠骨痂组织BMP 和BMPRIB mRNA 相对表达水平均明显升高（P ＜0.05）；与B 组相比，C 组和麦角甾苷各剂量组骨痂组织BMP 和BMPRIB mRNA 相对表达水平均明显上升（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性。给药8 周后，B 组、C 组和麦角甾苷各剂量组大鼠骨痂组织BMP 和BMPRIB mRNA 相对表达水平均明显下降（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性，但C 组和麦角甾苷各剂量组骨痂组织BMP 和BMPRIB mRNA 相对表达水平仍高于B 组（P ＜0.05）。

表3 各组骨痂组织BMP 和BMPRIBmRNA 表达水平比较（±s）

表3 各组骨痂组织BMP 和BMPRIBmRNA 表达水平比较（±s）

A 组B 组C 组D1 组D2 组D3 组4 周1.00±0.08 1.48±0.11ab 2.77±0.36ab 1.95±0.32abc 2.27±0.19abcd 2.82±0.28abde 8 周0.98±0.12 1.22±0.09a 1.71±0.14ab 1.39±0.14abc 1.50±0.10abcd 1.86±0.09abde 4 周1.01±0.09 2.04±0.19abc 3.05±0.61ab 2.39±0.24abc 2.61±0.39abcd 2.97±0.56abde 8 周1.00±0.06 1.53±0.37ab 2.13±0.29ab 1.68±0.12abc 1.85±0.20abcd 2.25±0.30abde组别BMP BMPRIB

2.5 骨痂组织BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表达水平

结果见表4。给药4 周后，与A 组相比，其余各组大鼠骨痂组织BMPRⅡ和Runx2mRNA 相对表达水平均明显升高（P ＜0.05）；与B 组相比，C 组和麦角甾苷各剂量组骨痂组织BMPRⅡ和Runx2 mRNA 相对表达水

平均明显上升（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂

量依赖性。给药8 周后，B 组、C 组和麦角甾苷各剂量组大鼠骨痂组织BMPRⅡ和Runx2 mRNA 相对表达水平均明显下降（P ＜0.05），麦角甾苷各剂量组反应呈剂量依赖性，但C 组和麦角甾苷各剂量组骨痂组织BMPRⅡ和Runx2 mRNA 相对表达水平仍高于B 组（P ＜0.05）。

表4 各组骨痂组织BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表达水平比较（±s）

表4 各组骨痂组织BMPRⅡ和Runx2 mRNA 表达水平比较（±s）

A 组B 组C 组D1 组D2 组D3 组4 周1.00±0.05 2.34±0.56a 3.92±0.89ab 2.74±0.35abc 3.08±0.41abcd 3.98±0.91abde 8 周1.04±0.09 1.54±0.25a 2.26±0.41ab 1.69±0.52abc 1.87±0.12abcd 2.28±0.39abde 4 周0.99±0.010 2.13±0.56a 4.02±0.20aab 2.52±0.36abc 3.10±0.52abcd 3.94±0.29abde 8 周1.00±0.04 1.40±0.27a 2.23±0.49ab 1.68±0.26abc 1.97±0.14abcd 2.24±0.15abde BMPRⅡ Runx2组别

3 讨论

肉苁蓉为补肾壮阳的传统中草药，麦角甾苷为其主要活性成分，可促进成骨细胞分化及骨愈合，防止骨质疏松等功效[7]。本研究结果表明，麦角甾苷可促进骨折大鼠骨痂形成，改善骨折大鼠愈伤组织的形成，这可能与其通过BMP/Runx2 信号通路促进成骨细胞的募集有关。复方骨肽注射液是临床常用治疗骨折的药物，通过与复方骨肽注射液治疗效果的比较，也进一步证实了麦角甾苷能促进骨折愈合[8]。

ALP 和BGP 在骨形成中起重要作用，ALP 为骨形成过程中的催化剂，从而促进类骨质形成和骨矿化；BGP可维持正常的骨矿化，抑制羟基磷灰石晶体的异常形成和软骨矿化的影响[9-10]。本研究结果显示，麦角甾苷治疗可增加血清ALP 和BGP 水平，但在第8 周时ALP 逐渐恢复至正常水平，而BGP 仍处于较高水平。可能与ALP 是由未成熟的成骨细胞分泌，主要存在于骨折愈合的早期阶段，而BGP 是由成熟的成骨细胞产生的，主要存在于骨折愈合的后期阶段[11-12]。本研究结果表明，麦角甾苷可促进血清骨形成因子分泌，促进骨形成。

多条信号通路（如BMP，Smad 和Runx2 通路）积极参与控制骨形成[13]。BMP 是骨形成的重要蛋白质，能刺激成骨细胞分化和骨形成，因为它的缺失会诱发自发性骨折[14]。BMP/Smad 信号由IB 型和Ⅱ型BMP 受体（即BMPRIB 和BMPRⅡ）及其下游分子Smad1、5 和8 介导，磷酸化的Smad1、5 和8 蛋白与Smad4 形成复合物，然后转运到细胞核中，与其他转录因子相互作用，如Runx2，这是成骨细胞分化的关键转录调控因子，BMP的下游靶点[15-16]。Runx2 蛋白为主转录因子，对于成骨细胞分化的BMP 信号传导的执行和完成至关重要[17]。本研究结果证实，麦角甾苷可促进骨痂组织中BMP，BMPRIB，BMPRⅡ和Runx2 mRNA 的表达，提示BMP/Runx2 信号通路参与了麦角甾苷诱导的骨折愈合。但本研究未测量Smad1、5 和8 蛋白磷酸化水平，同时如MAPK 信号通路在控制细胞增殖和分化中协同或独立地发挥重要作用，p38 MAPK 信号通路可以积极地调节成骨细胞增殖和分化，将在后续研究进行探索和完善[18]。

综上所述，麦角甾苷可促进骨折大鼠的骨折愈合，作用机制可能与激活BMP/Runx2 信号通路有关。