蚕豆幼苗内生固氮菌促生长特性的研究

王新南, 罗家豪, 郝俊杰, 张晓艳, 刘璐,付丽平, 王家林, 韩燕红, 刘全兰*

(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院, 山东 青岛 266042; 2.青岛市农业科学研究院, 山东 青岛 266100; 3.青岛市黄岛区农业技术推广站, 山东 青岛 266400)

蚕豆(faba bean,ViciafabaL.)又称罗汉豆、胡豆、兰花豆等，是一种粮、菜、肥兼用型豆科作物[1]，其在我国已有2 000余年栽培历史，种植面积广阔。豆科作物内生固氮根瘤菌，蚕豆也被期望含有丰富的内生固氮菌。熊惠洋[2]采集了我国三大蚕豆种植生态区(东部生态区、西南生态区、西北生态区)的44个样点里的蚕豆根瘤及土样，蚕豆根瘤里共分离纯化出6种和蚕豆结瘤的根瘤菌，分别是4个已知种(Rhizobiumleguminosarum、R.laguerreae、R.pisi/R.fabae、R.anhuiesnse)和2个未知种(R.sp.1、R.sp.2)。Saïdi等[3]从蚕豆根瘤中分离了104株内生固氮菌，它们分属于根瘤菌属(Rhizobiumsp.)、剑菌属(Ensifersp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、拉恩氏菌属(Rahnellasp.)、泛菌属(Pantoeasp.)、黄单胞菌属(Xanthomonassp.)和申氏杆菌属(Shinellasp.)等。固氮螺菌属(Azospirillumspp.)和固氮菌属(Azotobacterspp.)也是被分离报道的植物内生固氮菌，并广泛的应用于生物肥料[4-6]。类芽孢杆菌属(Paenibacillussp.)是从落地生根[6]、野生稻[7-8]和水稻[9]中分离被报道的内生固氮菌;克雷伯氏菌属(Klebsiellaspp.)是从野生稻、水稻、甘蔗、玉米等植物中获得的内生固氮菌[10-12],说明这些属在植物体内生固氮菌中是易分离得到的优势菌群。已有研究表明，内生固氮菌促生机制包括菌株的固氮、溶磷溶钾、产植物生长素等特性。黄静等[13]从油菜(汇油50)和玉米(登海11)中分离的 32 内生菌均株具稳定的溶磷能力，并研究了这些菌株形成吲哚乙酸、铁载体、1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶等的能力。Chimwamurombe等[14]从Marama豆苗期根和新枝中分离获得了73株内生菌，测定了它们的促生长特性，如1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶、1,3-β-D-葡聚糖内切酶、蛋白酶、固氮酶、吲哚乙酸、铁载体、N-酰基-高丝氨酸内酯、溶磷钾等的活性。本文从蚕豆幼苗叶和根中分离了内生固氮菌，同时探究了它们的促生长特性，为今后深入而广泛地研究蚕豆的内生固氮菌并应用于蚕豆生产奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蚕豆种子(日本大白皮，编号S18P23；启豆2号，编号S18P24)由青岛市农业科学院张晓艳课题组提供。2018年3月，在青岛市农业科学院塑料大棚用花盆进行播种，花盆内部直径35 cm，高75 cm，花盆内土(pindstrup泥炭，丹麦)高度为70 cm。种子出苗后20 d拔出蚕豆苗，自来水冲洗根上的土，包装于自封袋中于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 培养基

内生固氮菌分离纯化所用培养基为Ashby和YMA培养基，内生固氮菌生理生化测定用无机磷培养基、卵黄板培养基、硅酸盐培养基、羟基纤维素钠培养基、果胶筛选培养基。培养基溶解混匀后分装于 250 mL锥形 中，121℃灭菌 20 min。

Ashby筛选培养基(1 L)：KH2PO40.2 g、CaCO35 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、甘露醇 10.0 g、NaC1 0.2 g、CaSO4·2H2O 0.1 g、琼脂 18.0 g、pH(7.0±0.2)。

YMA培养基的成分(1 L)：甘露醇10.0 g、酵母粉1.0 g、K2HP040.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaC1 0.1 g、CaSO40.2 g、Rh微量元素液(H3BO35.0 g·L-1、Na2MnO45.0 g·L-1)4 mL，pH 6.8～7.0。

无机磷培养基(1 L)：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、FeSO4·7H2O 0.003 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母提取物0.5 g、磷酸钙5.0 g、琼脂18.0 g、蒸馏水1 000 mL；pH 7.0。

卵黄(有机磷)培养基(1 L)：葡萄糖10.0 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.03 g、NaC1 0.3 g、KC1 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.36 g、MnSO4·4 H2O 0.03 g、CaCO35.0 g、琼脂18.0 g；溶蒸馏水1 000 mL；加热溶化后分装于 250 mL锥形 中，于121 ℃灭菌 20 min；冷却至50 ℃后，立即加入灭菌的卵黄液，每100 mL的基础培养基加卵黄稀释液3 mL作为有机磷源，混匀后分装于培养皿内凝成平板。卵黄稀释液是用酒精擦净新鲜鸡蛋外壳，轻轻打破鸡蛋一端，去除蛋清后将蛋黄加入已灭菌的锥形瓶中，加等量的无菌水，摇匀后用灭菌注射器过滤而成。

硅酸盐培养基(1 L)：蔗糖10.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、酵母膏0.5 g、Na2HPO41.0 g、(NH4)2SO41.0 g、CaCO31.0 g、钾长石粉(过120目筛，蒸馏水浸泡 3 d以洗去水溶性钾)1.0 g、琼脂粉 18.0 g。

明胶培养基的成分(1 L)：牛肉浸膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、明胶120.0 g、pH 7.0，加热融化后，取4 mL培养液分装到10 mL的试管中。

羟基纤维素钠培养基(1 L)：羟基纤维素钠10.0 g、(NH4)2SO44.0 g、KH2P042.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨l.0 g、琼脂16.0 g。

果胶筛选培养基(1 L)：果胶0.2 g、KH2P040.1 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、NaN030.3 g、FeS040.001 g、琼脂2.0 g、pH 5.0。果胶为Sigma公司产品，从柑桔皮中提取的高酯果胶，甲氧基含量 9.3%，半乳糖醛酸含量 84.0%。

1.3 蚕豆内生菌分离纯化

将蚕豆幼苗的叶子和根用无菌水冲洗干净，70%酒精浸泡3 min，再用无菌水冲洗5～7次。取灭菌后的叶和根在培养基上涂抹1次，28 ℃ 培养5 d，以检查灭菌效果。用无菌保鲜膜将灭菌后的叶和根包裹并破碎，加1 mL生理盐水进行稀释，漩涡震荡1 min。取100 μL稀释混悬液涂布于Ashby培养基，28 ℃倒置培养48 h，挑取单菌落在固体平板上进行多次划线，得到纯化菌株。

1.4 菌株促植物生长特性测定

活化的供试菌株按10%接种量接种到Ashby培养基中，置于30 ℃摇床，恒温培养箱培养24 h，取1 mL培养液于600 nm处测吸光值，OD600为0.2时进行测试。无菌水制成浓度为107CFU·mL-1的菌悬液，吸取10 μL菌悬液注入到筛选平板的孔径中间，于28 ℃细菌培养箱中培养48 h，观察有无透明圈或混浊圈的生成，测定透明圈或混浊圈直径(L)和菌落直径(D)。固体培养基中注入菌液的孔径为0.6 cm。

1.4.1菌株溶磷和钾性状测定 分别将菌液接种到无机磷培养基、卵黄板培养基、硅酸盐培养基的孔中，置于30 ℃恒温培养箱培养1、3、7 d，观察培养基上透明环的形成及大小；7 d后，用直尺测定菌落和水解圈的直径，根据水解圈与菌落圈的直径比来判断该菌株溶无机磷、有机磷和钾能力。

1.4.2菌株液化明胶的测定 将菌液接种到明胶培养基的孔中，置于30 ℃恒温培养箱培养7 d，观察试管中的明胶状态，判断菌株是否有液化明胶的能力。有些明胶液化现象不明显，继续培养24 h后再次冷冻，重新观察结果。

1.4.3菌株产纤维素酶能力的测定 将菌株接种到羟基纤维素钠培养基的孔中，置于30 ℃恒温培养箱培养3 d，用质量浓度为1 g·L-1的刚果红溶液染色30 min，蒸馏水冲洗，用1 mol·L-1氯化钠溶液进行脱色，观察培养基上透明圈形成及大小，根据水解圈与菌落圈的直径比来判断该菌株产纤维素酶能力。

1.4.4菌株产果胶酶能力的测定 将菌株接种到果胶酶培养基的孔中，置于30 ℃恒温培养箱培养3 d，用质量浓度为1%的CTAB溶液染色10 min，观察培养基上有无透明圈形成及大小，根据菌落和水解圈的直径比判断该菌株产果胶酶能力。

1.4.5菌株固氮酶活性的测定 按照戴治家[15]方法测定菌株固氮酶活。取培养到对数期的1 mL菌液于13 mL西林瓶中，加橡胶塞，用注射器抽取西林瓶内1 mL空气，再注入1 mL纯度为99.99%的乙炔，28 ℃培养24 h。用注射器注入2 mL饱和氯化钠溶液，抽取200 μL气体(气体浓度为10%)，注入配制好的乙炔吸收液中，震荡5 min，在548 nm处比色法测定其吸收值。每个样品测定3个重复，取平均值进行分析。

标准曲线绘制：按照上述测定步骤，用空白培养基代替菌液，给盛有吸收液的5个瓶中，分别依次注入标准乙炔50、100、150、200和250 μL，进行比色，记录光密度，以OD值为纵坐标、乙炔含量为横坐标绘制标准曲线。

乙炔吸收液：称取 5.0 g 硝酸铜置 于 1 000 mL 容量瓶中, 加入200 mL蒸馏水使其溶解, 加入 10%的氨水溶液(氨量为5.3 g), 然后加入溶于380 mL蒸馏水中的23.0 g 盐酸羟胺溶液, 45 mL 2 %白明胶溶液和 33 mL 95%乙醇,混匀，加蒸馏水至标线充分摇匀, 放试剂瓶中备用。

内生固氮菌固氮酶活性以产生C2H4的浓度进行计算[15-16]。

固氮酶的活性(μmol C2H4·mL-1·h-1)=(V×C×c×n)/Vb×t

V=VO-Vt

c=[273/(273+t)]×(Pt/1×105)

式中,V为乙炔C2H2被还原形成乙烯C2H4的体积(μL)；C为理想状态下气体的浓度，0.045 mol·L-1;c为测定时的室内温度和大气压的修正系数，本研究测定温度为25 ℃，大气压Pt为1×105Pa，c= 0.916；n为 C2H2气体的稀释倍数，本研究西林瓶的容积是13 mL，注入1 mL菌液和2 mL饱和氯化钠溶液后的容积为10 mL，1 mL C2H2的稀释倍数是500；Vb为菌液的体积，为1 mL；t为菌株的培养时间，为24 h；VO为注入吸收液的标准乙炔气的体积(μL)；Vt为未被还原的乙炔体积,从标准曲线查得(μL)。

2 结果与分析

2.1 分离纯化结果

蚕豆幼苗叶和根经过两次分离纯化以后，得到菌落形态不同的内生固氮菌株共8株，其中叶中分离出6株，分别为SL23-2、SL23-3、SL24-1、SL24-2、SL24-3、SL24-5；根中分离出两株，分别为SR23-1、SR24-1。单菌落形态为圆形，不透明，菌落周围有分泌物。

2.2 蚕豆内生固氮菌的理化性质分析

筛选到的菌株分别培养在理化性状测定培养基上，观察抑菌圈的行成及直径大小，并比较分析不同菌株的活性能力，结果如表1所示。

2.2.1蚕豆内生固氮菌溶解无机磷和有机磷的特征 根据溶解无机磷的试验结果，有7株菌产生透明圈，仅SL24-3菌株不形成溶解无机磷的透明圈。在形成溶磷透明圈的菌株中，SL24-1、SL24-2、SL24-5、SR23-1的解磷能力较强，产生的解磷圈直径均超过2 cm。没有分离到溶解有机磷的菌株。结果表明，分离到的蚕豆内生菌溶解无机磷的效果显著，对于有机磷没有溶解能力(表1)。

表1 蚕豆苗期叶和根中内生固氮细菌促植物生长理化指标的测定

SR23-1菌株在溶磷培养基上形成的透明圈与菌落圈的直径比最大(4.78)，说明其对Ca3(PO4)2溶解效果最好，其次为SL24-1菌株(4.05)。其原因可能是SR23-1菌株产生的酸多，pH下降快，使Ca3(PO4)2中更多的磷溶解出来。已有研究表明，有机酸能够螯合金属离子，释放难溶的磷；不同的有机酸对金属离子的亲和性不同[13]。因此，在投入土壤环境前，应进一步测定SR23-1菌株的溶磷机制，测定溶磷物质与土壤特征的匹配度，这样将有利于土壤中磷元素的释放，将促进植物对土壤养分的充分吸收并将提高植物生物量。

2.2.2蚕豆内生固氮菌溶解钾的特征 从苗期蚕豆叶和根中分离的内生菌中仅有SL23-2和SR23-1两株菌有解钾的能力，解钾圈与菌落圈的直径比均在2.50左右(表1)，结合这两株菌形成的溶磷圈比值(2.17和4.78)，暗示这两株菌可以为蚕豆种植提供磷元素和钾元素。

2.2.3蚕豆内生固氮菌液化明胶的特征 菌株液化明胶试验是用于分析某些细菌可产生一种胞外酶——明胶酶的能力，该酶能使明胶等胶原物质分解为多肽再进一步分解成氨基酸，从而使明胶失去凝固力，使明胶固体培养基具有流动的特征。本研究从蚕豆中分离的内生菌仅SL24-2菌株有溶明胶的能力，其他菌株均无溶明胶能力(表1)。

2.2.4蚕豆内生固氮菌降解纤维素的特征 根据刚果红染料在羟基纤维素钠培养基上褪色的实验结果，具有纤维素酶活性的菌株共有4株SL23-2、SL23-3、SL24-3、SR24-1。降解纤维素的溶解圈直径平均在3.5 cm左右，说明这四株菌具有较强的纤维素酶分泌能力。SL23-3菌株在羟基纤维素钠培养基上形成的褪色透明圈与菌落圈的直径比值为最大(6.12)，说明其对羟基纤维素钠溶解效果最好，其次为SR24-1菌株(6.00)；这两株菌对无机磷还有一定的溶解效果，表明这两株菌在秸秆降解和农田溶磷中有一定作用。

2.2.5蚕豆内生固氮菌降解果胶的特征 在筛选分离的菌株中，具有果胶酶活性的菌株有两株SL24-1、SL24-3。果胶降解圈的大小为3.00 cm左右。SL24-1菌株在果胶培养基上形成的透明圈与菌落圈的直径比为5.88，SL24-3菌株在果胶培养基上形成的透明圈与菌落圈的直径比为3.95(表1)。SL24-1菌株还有溶解无机磷的能力，SL24-3菌株还有溶解纤维素的能力，说明这两株菌具有多种促生长能力(表 1)。

2.3 蚕豆内生固氮菌的固氮酶活性

2.3.1乙炔含量标线的绘制 乙炔分子中的氢原子易被银、亚铜、亚汞及汞等金属离子所取代，生成带色的金属炔化物，这是乙炔分子的特异反应, 乙烯(烯烃)无此反应。将1 mL乙炔气注入已抽取完1 mL空气的密闭的西林瓶中，含一价铜盐的氨溶液的吸收液与乙炔相互作用后将生成乙炔铜, 使溶液显紫红色，乙炔铜经分光光度计可得到数值，标准曲线如图1所示。

图1 乙炔含量的标准曲线

2.3.2蚕豆苗期内生固氮菌的固氮能力 8株固氮细菌的固氮酶活性如图2所示。固氮细菌的固氮酶活性差异较大，SL24-3菌株的固氮酶活性最高，为12.79 μmol C2H4·mL-1·h-1；SL24-2菌株的固氮酶活性次之，为11.79 μmol C2H4·mL-1·h-1。SL24-3菌株还有溶解纤维素和果胶的能力，说明这种菌在蚕豆的生长发育中发挥着多重效果；SL24-2菌株还有溶无机磷的能力，这说明该菌株对蚕豆生长的营养供给发挥着作用。

图2 8株内生固氮菌的固氮酶活性

3 讨论

近年来研究表明，宿主植物与其内生菌之间具有紧密联系，不同的宿主植物具有不同的内生菌生态系统；同种植物在不同的生活环境下，内生菌种类也会出现明显变化；植物不同部位间，内生菌的种类和丰度也具有显著差异，这反映出不同内生菌对宿主植物的组织差异性和专一性[17]。阳洁等[18]从药用稻中筛选到4株具有高效溶磷解钾能力的内生固氮菌，其固氮酶活性在8.78～8.88 μmol C2H4·mL-1·h-1之间，代表菌株yy01溶磷圈(L/D)为2.92,溶钾圈(L/D)为4.13。本研究在蚕豆苗期的根和叶中分离获得8株固氮菌，它们的固氮酶活为8.38～12.79 μmol C2H4·mL-1·h-1，其中SL24-3菌株的固氮酶活最高(12.79 μmol C2H4·mL-1·h-1)，SL24-2菌株的固氮酶活性次之(11.79 μmol C2H4·mL-1·h-1)，表明这两株菌有较好的固氮能力。本研究还发现4株菌株的溶磷能力强，SL24-1的溶磷圈(L/D)为4.05，SL24-2的溶磷圈(L/D)为4.04, SL24-5的溶磷圈(L/D)为3.62，SR23-1的溶磷圈(L/D)为4.78。这些结果说明蚕豆苗期内的内生固氮菌具有多样性的促植物生长特征。

细胞的生长是植物个体生长发育及形态建成的重要环节，需要一系列酶降解细胞壁的多聚糖以松弛胞壁，需要新的胞壁成份的添加、组装和交联。参与细胞壁降解的酶主要是纤维素酶和果胶酶，参与细胞壁合成的酶主要是过氧化物酶，这三类酶还可以提高植物对真菌病的抵抗力[19-20]。内生菌分泌的纤维素酶和果胶酶在植物促生长中的作用日益得到重视，如Borah等[20]从茶中分离到44株产纤维素酶和17株产果胶酶的内生菌。本研究内生固氮菌中有纤维素酶活性的为4株，果胶酶活性的菌株有2株，这些内生菌可以在蚕豆的生长过程中分泌出这些降解酶，以有利于蚕豆细胞壁的生长发育，还可以破坏病原真菌的细胞壁以防治真菌的病害。

综上所述，本研究的SR23-1菌株拥有突出的溶解无机磷和钾的能力；SL24-3菌株的固氮能力最高，还有分泌纤维素酶和果胶酶的能力，这说明这两株菌(SR23-1和SL24-3)在促植物生长能力方面有显著优势，是潜在的高效农业生产菌株。