牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备

布日额，吴金花, 锡林高娃，陈金龙,王金良

奶牛隐性乳腺炎(sub-clinical mastitis of dairy cattle)是奶牛养殖过程中的一种高发病，在内蒙古地区奶牛隐性乳腺炎的发病率在50%以上，患牛临床症状不易察觉，所产乳汁与健康奶牛所产奶没有较大的区别，在饲养管理不当、环境急剧变化等条件下极易转变为临床型乳腺炎[1-2]。无乳链球菌是引起奶牛隐型乳房炎的重要病原菌之一，属B群链球菌(Group BStreptococcusagalactea，GBS)，患病奶牛生产的乳由于质量差，营养成分遭到破坏，混有人畜共患无乳链球菌，故极易对人类造成感染性危害，特别是对机体免疫力低下的老人及婴幼儿其危害更为严重[3-4]。近年来，随着我国人均牛奶消费量的增加，奶牛养殖业的迅速发展和奶牛养殖密度的加大，再加上饲养福利条件相对较差,养殖环境卫生与消毒工作难以规范化实施，奶牛隐性乳腺炎的发病率有逐年上升趋势，每年因奶牛隐性乳腺炎所带来的直接或者间接经济损失巨大。

迄今为止，无乳链球菌的检测常用方法侧重于传统的细菌学分离鉴定，如常规PCR鉴定等，这些方法均存在程度不等的缺陷和不足。传统无乳链球菌的分离、培养、鉴定、检测方法耗时，仪器依赖性强，无法满足临床对乳腺炎乳样的快速检测[5-7]。胶体金免疫层析技术实施方便、快速，便于基层使用和现场推广使用，更加适合临床无乳链球菌乳样的快速检测[8-10]。在该检测技术产品的制备过程中，单克隆抗体的高灵敏度，强特异性使得免疫胶体金层析技术在快速鉴定病原体，以及准确的诊断方面发挥了关键作用。因此，制备无乳链球菌相关诊断亚单位抗原的单克隆抗体，具有良好的应用价值和市场前景。无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基基因编码类似大肠杆菌的菌毛样结构菌毛骨架蛋白部分，具有良好的抗原性，研究表明，该蛋白抗原可以作为无乳链球菌抗体的诊断抗原。本课题组在前期研究中，将BP抗原包被ELISA平板，用于临床无乳链球菌隐性乳腺炎的筛查，国外也有类似研究报道[11-12]。本研究在前期研究的基础上，将奶牛无乳链球菌的BP基因进行表达、纯化，制备单克隆抗体，经胶体金标记后制备了快速检测牛乳源性无乳链球菌的胶体金标记检测试纸条[13]。

1 材料与方法

1.1菌株、载体及实验动物 大肠杆菌BL21即用型感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司；SP2/0骨髓瘤细胞、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、化脓性链球菌等菌种、pET30a(+)-BP重组质粒由本实验室保存；Babl/c小鼠购自济南市金丰实验动物有限公司。

1.2主要试剂、器材 无乳链球菌山羊多克隆抗体为本实验制备并纯化保存，硫酸卡那霉素、IPTG、HIS标签蛋白亲和层析填料购自北京索莱宝科技有限公司；单抗亚类鉴定ELISA试剂盒购自上海士峰生物科技有限公司。低分子量蛋白Marker、HAT、PEG1500、胎牛血清等为Thermo公司产品。

1.4重组基因工程菌的诱导表达、纯化 将pET30a(+)-BP重组质粒克隆转化至BL21大肠杆菌感受态细胞中，经诱导表达后超声破碎，将表达产物进行SDS-PAGE分析，纯化及蛋白含量测定。

1.5抗BP重组抗原单克隆抗体的制备

1.5.1小鼠免疫 选择4只SPF级balb/c小鼠免疫，首免用纯化的BP蛋白50 μg与等量的弗氏完全佐剂乳化后皮下注射，然后每间隔14 d进行一次加强免疫，共免疫3次，每次每只50 μg抗原与等量的弗氏不完全佐剂乳化混匀。3次加强免疫后，检测小鼠血清效价，当效价达到1∶10 000时，用100 μg抗原冲击免疫，3 d后进行细胞融合与筛选。

1.5.2细胞融合与筛选 无菌采集小鼠脾细胞，加入少量HAT备用。收集培养好的骨髓瘤细胞洗涤3次，将脾细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合后，于37 ℃水浴1 min内缓慢加入1 mL的PEG，静置1 min。加入准备好的饲养细胞于37℃，5% CO2的孵化箱中培养7 d，待细胞长满孔底时用间接ELISA 方法进行筛选，检测为阳性的杂交瘤细胞扩大培养并冻存备用，将灭活的无乳链球菌(108CFU/孔)包被戊二醛预处理过的ELISA平板，对筛选出的阳性细胞株培养上清进行检测。

1.5.3单克隆抗体的制备与纯化 首先向小鼠腹腔注入弗氏佐剂致敏，7 d后每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水。收集腹水并离心去除腹水中的细胞和油脂，用硫酸铵沉淀法及亲和层析提取腹水中的IgG抗体，测得纯化抗体的浓度。

1.6单克隆抗体的鉴定

1.6.1克隆抗体效价及杂交瘤细胞株的稳定性 将细胞株连续传代15次，分别取细胞上清用间接ELISA方法检测抗体效价并比较其稳定性。

1.6.2抗体亚型鉴定 按照单抗亚类鉴定ELISA试剂盒说明书进行。

纳入和排除标准[2] ：①所有患者神经功能损害体征持续时间超过1 h，NIHSS评分≥4分，颅脑CT检查发现患者双侧基底节区多发性腔隙性脑梗死；②排除3个月内有卒中史和重大颅脑外伤史、可疑蛛网膜下腔出血、颅内出血既往史、颅内肿瘤、及型出血倾向、活动性内出血、血压异常升高（收缩压超过180 mmHg或舒张压超过100 mmHg）、不符合溶栓治疗适应征的患者。

1.7单克隆抗体的胶体金标记 使用4H5抗体标记金颗粒，抗体标记量为6μg/mL，标记pH值8.0，胶体金封闭液为10% BSA，无乳链球菌山羊多抗包被检测线，检测线喷涂抗体含量为1 mg/mL，质控线喷涂含量为1.5 mg/mL的羊抗鼠二抗，具体标记方法是利用杭州峰航科技有限公司的喷金标机和连续划膜机进行。

1.8金标试纸条灵敏度及特异性测试 将人工培养的乳腺炎无乳链球菌进行菌落计数，并梯度稀释至103～109CFU/mL，用制备的胶体金标记检测试纸条进行灵敏度测试。利用制备的胶体金检测试纸条分别对人工培养的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、化脓性链球菌含量均调整至108CFU/mL进行检测，测试其特异性。

2 结 果

2.1重组基因工程菌的诱导表达及蛋白纯化 重组 pET30a(+)-BP质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞，经终浓度为1 mmol 的IPTG诱导表达5 h后，经SDS-PAGE电泳显示，在约32 ku处出现清晰的目的条带。可溶性鉴定显示，目的蛋白主要存在于沉淀中，沉淀经变性、复性及His标签填料亲和层析纯化后，BCA法测定蛋白浓度为1.2 mg/mL(见图1)。

M为蛋白Marker；1为pET30a(+)-BP诱导后；2为诱导后上清；3为破碎沉淀； 4为纯化蛋白BP图1 BP重组蛋白表达及纯化SDS-PAGE鉴定Fig.1 Identification of recombinant protein expression and purification of BP by SDS-PAGE

2.2BP重组抗原单克隆抗体的制备 Balb/c小鼠经4次免疫后，ELISA检测小鼠血清抗体效达到1∶51 200(见图2)，融合细胞经多次亚克隆及筛选，再经玻片凝集试验对抗体进行二次筛选，获得1株稳定的抗BP重组抗原的单克隆抗体，将其命名为4H5。纯化后的单抗，经Bradford法测定，结果显示单抗含量为4.3 mg/mL(见图3)。

图2 4次免疫后小鼠血清效价Fig.2 Serum titers of mice serum after 4 times immunizations

M为蛋白Marker；1、2为纯化后的单抗4H5图3 单抗纯化后SDS-PAGE鉴定Fig.3 Identification of purified McAb by SDS-PAGE

2.3单克隆抗体的鉴定

2.3.1单抗腹水效价及杂交瘤细胞株的稳定性 经间接ELISA检测，4H5株单抗腹水的效价为1∶25 600。在细胞连续培养过程中，当连续传至15代时，其培养上清效价仍然稳定。

2.3.2单抗亚型鉴定 单抗亚型鉴定结果表明，该株单抗均属于IgG1亚类。

2.4胶体金试纸条灵敏度 灵敏度测试结果表明，制备的胶体金检测卡最低可以检测106CFU/mL的无乳链球菌(见图4)。

2.5胶体金试纸特异性 特异性测试结果表明，制备的胶体金检测卡与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、副结核杆菌、化脓性链球菌培养物人工污染牛乳均无反应，与无乳链球菌培养物人工污染牛乳样出现阳性反应(见图5)。

1为109 CFU/mL；2为108 CFU/mL；3为107 CFU/mL；4为106 CFU/mL；5为105 CFU/mL；6为104 CFU/mL；7为103 CFU/mL图4 胶体金试纸条灵敏度测试Fig.4 Sensitivity test of colloidal gold labeled strip

1为无乳链球菌；2为金黄色葡萄球菌；3为大肠杆菌；4为沙门氏菌；5为化脓性链球菌；6为副结核杆菌图5 胶体金标记试纸条特异性测试Fig.5 Specificity test of colloidal gold labeled strip

3 讨 论

无乳链球菌具有类似大肠杆菌的菌毛样结构，属于菌体表面附属物，能够促进细菌对宿主细胞的粘附和定植，并介导无乳链球菌对抗菌肽AMPs的抗性。相关研究表明，BP基因编码无乳链球菌菌毛结构中的骨架亚基部分，具有良好的免疫保护性[14-15]。国内已有学者曾尝试针对无乳链球菌致病因子制备单克隆抗体或者多克隆抗体，并应用于无乳链球菌的快速检测。张新艳等[16]成功制备了针对罗非鱼无乳链球菌的SIP蛋白的两株单克隆抗体，成功建立了针对罗非鱼无乳链球菌的双抗体夹心法ELISA检测方法，该检测方法的实际应用结果与PCR方法的符合率达到 98.33%。华亚南[17]于2016年制备了抗无乳链球菌多克隆抗体,建立了检测无乳链球菌的间接竞争ELISA法，并用此方法明确了罗非鱼感染链球菌数量与发病风险的关系。但是尚未见到针对奶牛乳腺炎无乳链球菌菌毛亚单位BP制备单克隆抗体，并制备胶体金快速检测试剂盒的研究报道。本课题组在前期研究中曾制备了针对牛乳腺炎Ia型菌株PI-2a菌毛岛屿3个亚基AP1-AP2-BP融合抗原的单克隆抗体，经胶体金标记制备检测试纸条，对无乳链球菌加检测后，结果显示效果不佳。所以，经进一步筛选，显示BP亚基抗原制备的单克隆抗体的检测效果良好，特异性及灵敏度均达到检测的要求。该研究属于首次开展针对无乳链球菌PI-2a菌毛亚单位BP制备单克隆抗体，并制备快速检测牛乳腺炎无乳链球菌的胶体金标记免疫层析试剂盒的研究。

本研究中共筛选出与无乳链球菌菌毛BP亚基蛋白有较好反应的38株杂交瘤细胞株，将无乳链球菌(108CFU)灭活后，包被戊二醛预处理的ELISA板，对筛选出的阳性细胞株培养上清进行二次筛选，最终筛选出1株与无乳链球菌特异性反应的杂交瘤细胞株，命名为4H5。该株单抗细胞经连续传代培养15代，其培养上清中单抗的效价依然稳定，最终制备的腹水抗体效价达到1∶256 00。利用胶体金标记该单抗，用无乳链球菌山羊多克隆抗体作为检测线，最终制备的胶体金检测卡最低可以检测106CFU/mL的无乳链球菌，制备的胶体金检测卡与人工培养的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、副结核杆菌等均没有交叉反应，这均表明制备的胶体金卡具有较好的特异性与敏感性。该研究成果为无乳链球菌性乳腺炎的快速检测及流行病学调查将提供有效的技术支持。

利益冲突：无。

引用本文格式：布日额，吴金花，锡林高娃,等. 牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿BP亚基单克隆抗体胶体金标记试纸条制备[J].中国人兽共患病学报，2020，36(1):45-49. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.186