小花清风藤茎叶提取工艺优化及保肝活性研究

张学学， 赵东晓， 李建桥， 卢顺光， 胡建忠， 李曼姝， 刘朝霞， 邹 坤

(1.三峡大学生物与制药学院 天然产物研究与利用湖北省重点实验室， 湖北 宜昌 443002；2.水利部水土保持植物开发管理中心， 北京 100038)

小花清风藤SabiaparvifloraWall. ex Roxb为清风藤科清风藤属植物，生境分布主要集中在我国广西、云南、贵州等地，为苗族、布依族的民间用药，在民间有“黄肿药”、“小黄药”、“黄眼药”等俗称[1-3].因其具有清热利湿、止血的作用，故主要用于治疗湿热黄疸、肝炎、止血等[4-7].根据文献报道，小花清风藤含多种潜在活性化学成分，主要包括生物碱类、五环三萜类、黄酮类及苯丙素类等[8-11].本课题组此前研究表明小花清风藤茎叶自然混合的不同溶剂提取物对急性酒精性肝损伤小鼠及CCL4致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用，且其作用机制可能与其抗氧化作用有关[12-13]，同时，小花清风藤茎叶的石油醚萃取部位分离所获24-羟基-3-氧代-12-齐墩果烯-28-酸，β-谷甾醇，豆甾醇和齐墩果酸4种化合物，均具有显著的肝保护作用[14].刘易蓉、邱晓春等研究也表明小花清风藤提取物对2种肝损伤模型小鼠血清AST、ALT的活性有一定降低作，具有一定的肝保护作用[4].此外，本课题组还对小花清风藤中含有的微量元素及挥发油成分进行了研究[15-16]，但目前小花清风藤水提物的提取工艺尚不明确.为进一步开发这一药用资源，本研究以CCl4损伤后的LO2细胞活性为指标，采用正交试验法研究其提取工艺.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 HH-S4数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器有限公司)；500 mL锥形瓶(天津天玻玻璃仪器有限公司)；电子分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；涡旋振荡器(美国奥然科技有限公司)；高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；CO2培养箱(日本Sanyo公司)；超净工作台(上海博讯实业有限公司)；台式高速离心机(德国Eppendorf公司)；Tecan多功能酶标仪(瑞士TECAN集团公司).

1.1.2 试剂 本研究使用了CCl4、胰蛋白酶溶液(称取0.25 g胰蛋白酶，加入80 mL×PBS缓冲液，完全溶解后，定容至100 mL，过滤除菌，4℃保存)；1640培养基(将1640粉末溶于800 mL去离子水，再加入NaHCO3定容至1.0 L，0.22 μm过滤灭菌，4 ℃保存备用)；小牛血清；二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐(20.0 mg 二甲基噻唑二苯基四唑嗅盐溶于4.0 mL的PBS，充分溶解，4 ℃避光贮存)；二甲基亚砜等材料试剂.此外本次试验使用的小花清风藤采收于广西省百色市那坡地区，经本院天然产物研究与利用湖北省重点实验室杨进教授鉴定为清风藤属植物小花清风藤SabiaparvifloraWall. ex Roxb.

1.2 小花清风藤提取方法

小花清风藤茎叶阴干后，粉碎过100目筛.准确称取10 g药粉，分别按照料液比1∶10、 1∶20、 1∶30加入纯水，浸泡30 min，分别在60 ℃、80 ℃、100 ℃的水浴锅中加热1 h、2 h、3 h，用布氏漏斗进行抽滤，浓缩定容至总体积为 500 mL 后，冷冻干燥，直至成干膏.

1.3 细胞LO2的复苏与培养

人正常肝细胞株LO2购自北纳生物科技有限公司.预热培养基，30 min后，向培养瓶中加入8.0 mL已预热的培养基，取出冻存于液氮中的LO2细胞株，迅速投至37 ℃的水浴锅中，不断振摇.取出冻存管，75%酒精擦洗消毒，将冻存的细胞悬液吸至培养瓶中，混和均匀后，移入培养箱中37 ℃、5%CO2条件下培养.当细胞单层长到80%时，用0.25%的胰蛋白酶消化，传代.将处于对数生长期的肝细胞LO2用0.25%胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清的1640培养基悬浮，用玻璃管轻轻吹打成单细胞悬液，倒置显微镜下用细胞计数板计数，调整细胞浓度为1×105个·mL-1.将细胞接种于96孔板中，每孔100 mL，置于37 ℃、5%CO2的孵箱培养24 h.

1.4 保肝活性测定

1.4.1 肝损伤模型建立 采用上述方法培养细胞并分为模型组和空白对照组，吸取10 mLCCl4溶于100 mL的含10%FBS的1640培养基中，制成饱和的CCl4培养基溶液；模型组加入含CCl4饱和的培养基溶液100 mL/孔，空白对照组加入含10%FBS的1640培养基100 mL/孔，将加好溶液的培养板置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h.采用四唑盐(MTT)比色法对比模型组与空白对照组的LO2肝细胞存活率，模型组LO2肝细胞存活率显著低于空白对照组即为造模成功.

1.4.2 细胞培养与药物处理 实验分为正常组(空白对照组)、模型组、给药组(高、中、低剂量).吸取10 mLCCl4溶于100 mL的含10%FBS的1640培养基中，制成饱和的CCl4培养基溶液.用饱和的CCl4培养基溶液溶解药物致不同浓度，每个浓度设3个复孔，药物浓度为药液终浓度为25、50、100 μg·mL-1，正常组加入含10%FBS的1640培养基100 mL·孔-1，模型组加入含CCl4饱和的培养基溶液100 mL·孔-1，给药组加入样品溶液100 mL/孔，将加好溶液的培养板置37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h.

1.4.3 肝细胞L-O2存活率测定 采用四唑盐(MTT)比色法，测定前4 h，每孔加入20 μL的MTT液(5 mg·mL-1)，终止培养，吸弃上清，加入DMSO 150 μL·孔-1，待结晶溶解后，于全自动酶标光度计492 nm处，测定每孔的吸光度值，计算肝细胞LO2的存活率.

采用该方法测定提取时间、提取温度和料液比3个因素对小花清风藤水提取肝保护活性的影响，并在此基础上设计正交试验优化小花清风藤的最佳提取工艺条件.

1.5 统计分析

本实验数据采用单因素分析、正交试验设计和显著性差异统计方法进行处理和分析.正交试验数据由Minilab软件分析处理.

2 结果

2.1 单因素试验结果分析

如表1所示，1、2、3组实验考察提取时间对提取物活性的影响，4、5、6组实验考察料液比对提取物活性的影响，7、8、9组实验考察提取温度对提取物活性的影响.

表1 单因素试验结果

续表1

2.1.1 提取时间对提取物活性的影响 从图1可见，在提取时间为3 h的条件下，得到的提取物加入被CCl4损伤后的LO2细胞的活度更接近正常的LO2细胞，但考虑在成本情况下，提取时间不再延长，因此正交试验选择提取时间为1 h、2 h、3 h的3 个水平来进行实验.

图1 提取时间对提取物的肝保护活性的影响Fig.1 Effect of extraction time on liver protective activity of extracts

2.1.2 料液比对提取液活性的影响 从图2可见，在料液比为 1:20的条件下，得到的提取物加入被CCl4损伤后的LO2细胞的活度更接近正常的LO2细胞，因此正交试验选择料液比为1∶10、1∶20、1∶30的3个水平来进行实验.

图2 料液比对提取物肝保护活性的影响Fig.2 Effect of feed-liquid ratio on liver protective activity of extracts

2.1.3 提取温度对提取物活性的影响 从图3可见，在提取温度为100 ℃的条件下，得到的提取物加入被CCl4损伤后的LO2细胞的活度更接近正常的LO2细胞，考虑到水常压下的沸点是100 ℃，因此正交试验选择提取温度为 60 ℃、80 ℃、100 ℃的3个水平来进行实验.

图3 提取温度对提取物肝保护活性的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on liver protective activity of extracts

此外本次单因素试验的给药组设计了3个浓度，分别为25 μg·mL-1、50 μg·mL-1和100 μg·mL-1，结果表明在9组试验中100 μg·mL-1的药液活性较高，因此在正交试验中给药组的药液浓度为100 μg·mL-1.

2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验结果确定正交因素水平表(表2)，正交试验结果(表3)，其中因素A、B、C分别代表提取时间、提取温度及料液比.观察表3中K值可知: 料液比因素，K2最大，所以因素C选择水平为1∶20.提取温度因素，K2最大，所以因素B选择水平为 80℃.同理看出提取时间因素中选择的水平为 1 h.因此，9次正交试验最优提取工艺为A1B2C2，即料液比为1∶20，提取时间为1 h，提取温度为80 ℃.观察R值可知：RB>RC>RA，则其影响顺序为B>C>A，即提取温度>料液比>提取时间.

表2 正交因素水平表

注：A=提取时间/h，B=提取温度/℃，C=料液比

表3 正交试验结果

应用Minilab统计学软件进行正交试验的结果分析(表4)，方差分析表明因素A对其提取效果的影响具有明显的显著性.比较F值，有FB>FC>FA，可知在本实验中影响提取物活性A、B、C三因素中的影响次序是B>C>A，与计算结果一致.

表4 正交试验结果方差分析

2.3 验证试验

按照最佳提取条件A1B2C2提取3次进行条件验证，结果细胞存活率115.05%、115.15%、116.60%为正交试验数据中最佳，RSD=0.75%，表明选择的提取工艺合理.

3 讨论

本文采用正交试验与保肝活性评价相结合的方法优选小花清风藤中活性成分的提取方法，结果表明3个因素对实验结果的影响从大到小依次为提取温度、料液比、提取时间，其最佳提取工艺为料液比为1∶20，80 ℃提取2 h.本试验以提取物的肝保护活性为指标研究小花清风藤的提取工艺，该方法不同于刘易蓉、潘国吉等[17-19]以小花清风藤中槲皮素、齐墩果酸及黄酮等物质基础为指标研究其提取工艺.

此外李玉玲等[13]研究表明小花清风藤对CCl4致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用，可减轻CCl4对肝脏的脂质过氧化损伤，降低肝组织中ALT和AST活性，升高肝组织中SOD和GSHPx含量， 降低肝组织中MDA含量，从而减轻CCl4对肝组织氧化应激损伤，改善肝脏病理组织学形态，保护肝细胞从而恢复肝功能，并验证其作用机制与其抗氧化作用有关.本次试验按照中药提取条件的常规设计[20]，在本文的方法下提取得到的提取物对CCl4损伤后的LO2细胞的细胞存活率为115.60%，活性相对较高，且该方法精密度与重复性都较好，为进一步开发与利用小花清风藤提供了科学依据.