母子两代连续双酚A暴露对子鼠睾丸发育的影响

张石磊,包佳鹭,史万玉∗,钟秀会∗ (1.河北农业大学 动物科技学院,河北 保定071001;.河北农业大学中兽医学院,河北 保定071001)

双酚A(bisphenol A,BPA)是苯酚和丙酮的重要衍生物,多用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂等高分子材料。还可用于生产增塑剂、阻燃剂、抗氧剂、热稳剂、橡胶防老剂、农药、涂料等精细化工产品中[1]。据估计,全世界每年BPA 生产量在680 万t以上[2],而中国2016年BPA 的年生产量就达到141 万t[1]。BPA是普遍存在的一种环境内分泌干扰物,具有拟雌激素、拮抗雄激素的作用[3]。研究发现,一定浓度的BPA 暴露会严重影响动物生殖系统的发育和功能[4-6]。BPA 在环境污水,河流中均有存在[7-8],牛奶[9],输液用膜制袋中[10],桶装水的水桶中[11],易拉罐啤酒[12]和塑料桶装白酒中[13]均有BPA 检出。而且,BPA 也存在于人体体液样本如血液、尿液、唾液、羊水和母乳中[14-15]。有资料指出,室内灰尘中便含有BPA,办公室内BPA 的含量是居室的5～10倍[16]。可见BPA 几乎无处不在。

关于BPA 对人和动物生殖危害性的研究已有报道[3,17-18]。已知BPA 可引起雄性动物睾丸萎缩[19],生殖细胞核DNA 断裂[20],导致细胞凋亡[21]。郑劼[22]报告,BPA 暴露降低雄性小鼠精子数量和活性,增加精子的畸形率。雄激素受体(androgen receptor,AR)作为调节基因表达的DNA 结合转录因子[23],对于维持雄性动物的性表型和促进其发育发挥重要作用[24],而BPA 可以通过干扰AR 而扰乱雄性动物睾丸发育和正常功能[25]。转录组学测序常应用于差异基因筛选及功能注释[26],目前研究转录组的方法主要基于测序技术[27]。与传统的分析技术相比,转录组测序分析可以获得更全面的数据[28]。转录组测序数据常通过基因功能数据库(gene ontology,GO)[29]和基因代谢通路数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)进行注释分析[30]。本研究令雌鼠孕期和哺乳期饮水染毒BPA,并在子代雄鼠21日龄断奶至45日龄性成熟[31]一直饮水染毒BPA,检测睾丸组织学和雄激素受体变化,精子质量,以及睾丸细胞中DNA 损伤等指标,以分析胚胎期至雄鼠性成熟期长期暴露BPA 对睾丸发育的影响,为进一步研究环境激素BPA 损伤雄性生殖提供基础资料,为环境安全研究提供有价值的参考数据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与BPA处理8周龄SPF 级昆明小鼠雌性200只,雄性100只,体质量25～30 g,购于北京斯贝福实验动物中心,许可证号:SCXK(京)2016-0002。经环境适应1周,雌雄2∶1合笼过夜,次日早晨检出阴栓为孕0 d。将孕0 d母鼠随机分为7组,每组20 只。A 组为空白对照组,B 组为0.05 mg·kg－1·d－1BPA处理组,C组为0.50 mg·kg－1·d－1BPA 组,D 组为5.00 mg·kg－1·d－1BPA 组,E 组 为10.00 mg·kg－1·d－1BPA 组,F 组为20.00 mg·kg－1·d－1BPA组,G组为50.00 mg·kg－1·d－1BPA 组。自F0母鼠孕0 d起至哺乳期结束,母鼠饮水染毒BPA,仔鼠21 日龄断奶后继续饮水染毒BPA 至45 日龄性成熟期,共染毒63 d。取BPA(纯度≥99%,Sigma,美国)配成50.00 g/L的BPA 母液,置于4℃保存,使用时按所需浓度用自来水配稀释,加入防漏水的专用小鼠饮水瓶以确保饮水量的准确。每3 d称量小鼠体质量,测量饮水量,准确计算饮水给药(BPA)的剂量。

1.2 样品采集与检测分析在子代雄鼠性成熟时(45日龄)眼眶静脉丛采血,脱颈处死。分离血清样品置于－80℃保存。摘取睾丸,称重,按双侧睾丸质量(mg)占体质量(g)的百分比计算睾丸器官指数。摘取新鲜附睾100 mg置于400μL 生理盐水(37℃恒温)中剪碎并轻轻震荡,得到精子悬浊液,用于检测精子活力、精子密度和畸形率。取部分睾丸样品匀浆后用于BPA 含量测定。使用小鼠BPA检测试剂盒(上海润裕生物科技有限公司,Lot No,RY-12919),按照说明书操作,检测子代雄鼠血清及睾丸匀浆中BPA 的含量;一部分睾丸样品置于4%多聚甲醛固定,制备石蜡切片。一部分切片进行H&E染色,观察不同剂量BPA 对睾丸组织的病理损伤情况。一部分切片用于检测小鼠睾丸组织AR表达变化(一抗为兔抗鼠 AR 单克隆抗体,ab133273,Abcam 公司,美国;二抗为羊抗兔多克隆抗体,SV0001,博士德生物技术有限公司,中国);取部分新鲜睾丸立刻进行单细胞凝胶电泳(彗星试验),检测睾丸DNA 损伤。将睾丸组织剪碎后加入RMPI 1640培养基,震荡得到细胞悬液,细胞悬液加入低熔点琼脂糖溶液中,混匀后涂抹至载玻片上进行电泳,电泳结束后使用溴化乙锭染色,通过图像分析系统CASP量化DNA 损伤[32];取部分睾丸样品置于液氮冷冻保存,用于提取总RNA 进行转录组测序,总RNA 提取和反转录试剂盒购自Promega。使用Illumina测序平台Illumina HiSeq,对空白对照组和50.00 mg·kg－1·d－1组小鼠睾丸进行转录组测序。测序结果经比对得到差异基因后将差异基因导入GO 数据库和KEGG 数据库进行注释分析,对差异基因进行荧光定量PCR 验证。荧光定量PCR 采用两步法,体系为20μL,其中荧光定量PCR Mix 10μL,上、下游引物各1μL,引物序列如表1所示,cDNA 模板2μL,dd H2O 6μL。扩增程序为:95℃600 s;95℃30 s,60℃10 s,45个循环。熔解曲线程序为:95.0℃10 s,65.0℃60 s然后以0.2℃/s的速度升温至97.0℃,最后37.0℃30 s冷却。

表1 荧光定量PCR 引物序列

1.3 统计学方法使用Image J对免疫组化结果进行灰度值分析,使用CASP 软件对彗星试验结果进行分析。试验数据录入SPSS 19.0 软件进行分析,结果以±s x表示。数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和卡方检验(χ2)与空白对照进行比较,P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 血清和睾丸组织BPA 含量根据试剂盒所含的标准品计算的标准曲线线性回归系数R2和回归方程,当R2≥0.920 0时,测量结果可信。本次试验中R2＝0.998 5。测定结果显示,BPA 暴露剂量不低于10.00 mg·kg－1·d－1时,子代雄鼠血清BPA含量显著高于(P＜0.05)空白对照组,BPA 暴露剂量不低于20.00 mg·kg－1·d－1时,子代雄鼠睾丸组织BPA含量显著高于(P＜0.05)空白对照组(表2)。

表2 子代雄鼠血清和睾丸中BPA 的含量

2.2 睾丸器官指数从睾丸器官指数的结果可以看出,G 组睾丸器官指数与A 组相比显著增加(P＜0.05),即BPA 暴露剂量在50.00 mg·kg－1·d－1时,会导致子代雄鼠睾丸指数显著增大(表3)。

表3 睾丸器官指数

2.3 睾丸组织病理学变化H&E染色结果可以看出(图1),A 组睾丸生精小管几乎无空隙。而BPA暴露各组生精小管均不同程度地出现裂隙或空腔。当BPA 暴露剂量在10.00 mg·kg－1·d－1以上时,会导致睾丸生精小管萎缩,小管间隙明显变大(图1E)。

图1 睾丸组织病理学变化 A.空白对照组;B.0.05 mg·kg－1·d－1组;C.0.50 mg·kg－1·d－1组;D.5.00 mg·kg－1·d－1组;E.10.00 mg·kg－1·d－1组;F.20.00 mg·kg－1·d－1组;G.50.00 mg·kg－1·d－1组;箭头1所指位置为生精小管间隙;箭头2所指位置为生精小管空腔。图中标尺长度为50μm

2.4 雄鼠精子指标BPA 暴露0.05 mg·kg－1·d－1剂量组小鼠的精子活力和精子密度与空白对照组无显著性差异,BPA 在0.50 mg·kg－1·d－1以上剂量组的精子活力均显著减少,精子密度亦显著减少。各BPA暴露组精子畸形率均显著大于空白对照组(图2,表4)。

2.5 睾丸生殖细胞DNA 损伤结果结果可见C～G 组睾丸生殖细胞损伤显著大于空白对照组(P＜0.05),这 表 明BPA 暴 露 剂 量 为0.50,5.00,10.00,20.00,50.00 mg·kg－1·d－1时,子代小鼠睾丸生殖细胞损伤显著大于空白对照组(图3,表5)。

2.6 睾丸AR 表达变化由免疫组化结果可以看出AR 主要表达于睾丸间质细胞(图4箭头所指)。B、C、D、E、F 和G 组AR 表 达 量 显 著 低 于A 组(P＜0.05),即BPA 暴露剂量在大于等于0.05 mg·kg－1·d－1即可导致子代雄鼠睾丸AR 表达量显著减少(图4,表6)。

2.7 睾丸基因表达变化

2.7.1 睾丸显著性差异表达基因 将BPA 50.00 mg·kg－1·d－1组和空白对照组2组的子代雄鼠睾丸进行转录组测序比较,结果显示,雌鼠染毒BPA,其子代雄鼠相较于空白对照组共有28个显著性差异表达基因,其中16 个基因上调,12 个基因下调(图5)。

图2 雄鼠附睾精子伊红染色 A.空白对照组;B.0.05 mg·kg－1·d－1组;C.0.50 mg·kg－1·d－1组;D.5.00 mg·kg－1·d－1组;E.10.00 mg·kg－1·d－1组;F.20.00 mg·kg－1·d－1组;G.50.00 mg·kg－1·d－1组。箭头所指为精子

表4 精子活力指标统计结果

图3 睾丸中生殖细胞核DNA 损伤结果 A.空白对照组;B.0.05 mg·kg－1·d－1组;C.0.50 mg·kg－1·d－1组;D.5.00 mg·kg－1·d－1组;E.10.00 mg·kg－1·d－1组;F.20.00 mg·kg－1·d－1组;G.50.00 mg·kg－1·d－1组;箭头所指为荧光染色的生殖细胞的DNA

2.7.2 BPA 影响睾丸显著性差异表达基因功能的注释 差异基因功能按照生物进程、细胞组分和分子功能3个基因功能分类。结果显示BPA 暴露后雄鼠睾丸差异基因均与生物合成代谢过程有关(图6)。

2.7.3 差异基因KEGG 富集 差异基因KEGG 富集结果显示剪切体代谢通路显著富集。其中剪切体U1亚基蛋白质C合成基因Snrpc和剪切体通用载体组件编码基因Hnrnpu均显著下调(图7)。

2.7.4 荧光定量PCR 验证 荧光定量PCR 检测了全部7组睾丸组织Snrpc和Hnrnpu表达水平,并以β-actin为内参基因校正不同组织RNA 得率的误差。结果显示Snrpc和Hnrnpu随BPA 染毒剂量增加而减少(图8),与转录组测序结果一致,但从荧光定量PCR 结果我们可以发现Hnrnpu对BPA 更加敏感,在BPA 染毒剂量0.50 mg·kg－1·d－1以上时,Hnrnpu表达量减少为空白对照的1/2以下,而Snrpc在BPA 染毒剂量20.00 mg·kg－1·d－1以上时表达量减少为空白对照的1/2以下。

表5 睾丸生殖细胞DNA 损伤结果

3 讨论

BPA 通常被认为是环境雌激素,但对雄性生殖亦能产生影响[33]。小鼠雄性性成熟时间为40～60 d,平均45 d[31]。为了探究雄鼠连续接触BPA对其发育的影响,本试验自F0雌鼠孕0 d起至哺乳期结束,雌鼠饮水染毒BPA,仔鼠21 d断奶后以雌鼠染毒剂量饮水染毒子代雄鼠至45 d性成熟期,共染毒63 d,探究BPA 对雄鼠生殖发育的影响。在胚胎发育时期BPA 可穿过胎盘影响胎儿发育[34],BPA 亦可穿过血睾屏障,影响睾丸发育[35]。BPA在组织中的含量与暴露剂量成正比[36],本研究发现较高剂量BPA(≥20.00 mg·kg－1·d－1)可使45 d雄鼠睾丸BPA含量显著升高(表1),这证明BPA 可通过血睾屏障。

图4 睾丸AR 表达量 A.空白对照组;B.0.05 mg·kg－1·d－1组;C.0.50 mg·kg－1·d－1组;D.5.00 mg·kg－1·d－1组;E.10.00 mg·kg－1·d－1组;F.20.00 mg·kg－1·d－1组;G.50.00 mg·kg－1·d－1组;箭头所指为AR 阳性表达细胞

表6 睾丸AR 表达量

睾丸器官指数和石蜡切片H&E染色的结果显示在雄鼠的性成熟期,染毒BPA 剂量在50.00 mg·kg－1·d－1时可导致睾丸器官指数显著增大(P＜0.05),而10.00 mg·kg－1·d－1以 上 剂 量 的BPA导致睾丸生精小管间隙变大,这表明只有较高剂量的BPA 才会引起睾丸组织的病理变化。精子活力指标的测定结果显示0.50 mg·kg－1·d－1以上剂量BPA 可使得精子密度、精子活率显著下降(P＜0.05),0.05 mg·kg－1·d－1以上剂量BPA 可使精子畸形率显著上升(P＜0.05),这意味着极低的BPA 接触剂量即可导致精子质量下降。韩茂之等[37]研究了哺乳期染毒BPA 对后代成年小鼠睾丸发育和精子生成的影响,证明了BPA 对雄鼠睾丸发育具有明显影响,会导致精子畸形率增加,曲细精管直径减小,生精上皮变薄,与本研究结果一致。有研究显示BPA 可导致睾丸细胞生殖凋亡[38],而彗星试验可以灵敏的检测细胞核DNA 的损伤[39]。本研究中使用彗星试验的方法检测了不同剂量染毒BPA 对后代小鼠睾丸中生殖细胞的影响,结果显示0.50 mg·kg－1·d－1以上剂量染毒会导致生殖细胞核DNA 的损伤显著大于空白对照(P＜0.05),与精子活力的测定结果一致。从试验结果可以看出极低剂量BPA 即可引起精子异常,而较高剂量BPA才能引发睾丸发育异常,这也说明了精子发生的异常并非由睾丸发育异常引起的,而是BPA 直接引起的。同时也证明了低剂量BPA 的毒性是确实存在的,最新的研究也显示了低剂量的BPA 暴露影响精子发生[40]。

图5 差异表达基因火山图 有显著性差异表达的基因用红色点(上调)和蓝色点(下调)表示,无显著性差异表达的基因用蓝色点表示

图6 差异基因GO 富集

图7 差异基因KEGG 富集

图8 Snrpc 和Hnrnpu 基因相对表达量 A.空白对照组;B.0.05 mg·kg－1·d－1组;C.0.50 mg·kg－1·d－1组;D.5.00 mg·kg－1·d－1 组;E.10.00 mg·kg－1·d－1组;F.20.00 mg·kg－1·d－1组;G.50.00 mg·kg－1·d－1组

AR 通过与睾酮结合激活转录因子功能,促进雄性性分化和成熟[41],BPA 可以阻止睾酮与AR 结合,抑制AR 转录活性[42]。本试验发现染毒BPA 0.05 mg·kg－1·d－1以上,睾丸AR 表达量显著减少。这证明BPA 在低剂量(≥0.05 mg·kg－1·d－1)就可以通过抑制睾丸AR 表达。

低剂量染毒BPA一般指经口染毒剂量在0.05～50.00 mg·kg－1·d－1之间[43]。为了探究持续染毒BPA 对雄鼠睾丸发育的影响机制,本试验对空白对照组和50.00 mg·kg－1·d－1BPA 组子代睾丸进行转录组测序,结果显示子代雄鼠睾丸共有28个显著性差异表达基因,其中16个基因上调,12个基因下调。我们将差异基因与GO 数据库比对,发现差异基因富集于生物合成代谢过程。差异基因与KEGG 数据库比对,剪切体代谢通路显著富集。剪接体是真核生物m RNA 前体去内含子转变成熟工具,由5个亚基(U1,U2,U4,U5和U6)和150多种结构蛋白质组成的核糖核蛋白复合物(sn RNP)[44]。本试验中剪切体U1亚基蛋白质C合成基因Snrpc和剪切体通用载体组件编码基因Hnrnpu均显著下调。剪接的最初步骤是将U1 snRNP 及通用蛋白组件与未成熟的m RNA 的5′剪接端结合[45],Snrpc和Hnrnpu的显著下调使得m RNA 的转录后修饰第1步即无法进行,剪切体功能受阻可能是BPA 影响睾丸发育的重要原因。荧光定量PCR 结果显示持续染毒BPA 可降低子代睾丸Snrpc和Hnrnpu的表达量,且Hnrnpu对BPA 的敏感性大于Snrpc。