日粮硝酸钾添加量对湖羊瘤胃细菌群落结构的影响

■林 淼 陈志远 巩 帅 封丽梅 王阔鹏 胡梓轩

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

硝酸盐是一种非蛋白氮类型，在瘤胃中可被微生物还原，以亚硝酸盐为中间产物最终生成氨，并再次被微生物利用，合成菌体蛋白[1]。因此，目前认为瘤胃微生物是调控硝酸盐还原的主要原因。林淼等[2]的体外培养试验表明，瘤胃细菌和原虫是主要的硝酸盐还原微生物，而真菌对其的还原能力忽略不计。目前报道的硝酸盐还原菌主要包括反刍兽新月单胞菌（Selenomonas ruminantium）、小韦荣氏球菌（Veillonella parvula）、产琥珀酸沃廉菌（Wolinella succinogenes）、产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens）、胎儿弯曲杆菌（Campylobacter fetus），其中反刍兽新月单胞菌的数量最多[3-5]。Zhou等[6]体外培养研究表明，添加5 mM 硝酸盐降低了产琥珀酸丝状杆菌，瘤胃白色球菌和瘤胃黄色球菌的丰度，随着培养时间延长、瘤胃白色球菌和瘤胃黄色球菌的数量增加，说明瘤胃内的某些细菌能够适应硝酸盐。Zhao等[7]在肉牛日粮中添加2%硝酸盐（干物质基础）增加了反刍兽新月单胞菌、产琥珀酸曼氏杆菌和胎儿弯曲杆菌的相对丰度。目前硝酸盐对湖羊瘤胃微生物区系影响的研究较少。本试验在湖羊日粮中添加不同剂量的硝酸钾，采集瘤胃液进行16S rDNA 测序分析，研究硝酸盐对瘤胃细菌的影响，对明确硝酸盐在瘤胃内的微生物还原机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选取3头9月龄，体重相近（30±5）kg且装有永久性瘤胃瘘管的健康湖羊，日粮配方参照参照NRC（2007）的成年羊的营养需要，具体营养成分见表1。以不添加硝酸钾为对照（A），逐量增加硝酸钾的添加量至6（B）、12（C）、18（D）、24（E）、30（F）g/d。每个添加梯度设置14 d 预试期，2 d 采样期。试验羊每天饲喂两次（9:00和16:00），自由饮水，保持羊舍适宜的光照和通风，定期消毒。

表1 基础日粮组成和营养水平(风干基础)

1.2 方法

1.2.1 样品采集和DNA提取

采集晨饲后2 h的瘤胃内容物，以4层纱布过滤，立即带回实验室，使用粪便基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取总DNA，用微量核酸蛋白检测仪测定DNA 浓度，并以1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 高通量测序

用无菌超纯水稀释DNA 样品浓度至1 ng/μl，使用带Barcode 的引物序列515F 5’GTGCCAGCMGCCGCGGTAA 3’，806R 5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3’扩增16S V4区，根据PCR产物浓度进行等浓度混样。使用New England Biolabs 公司的NEB Next®Ultra™DNA Library Prep Kit for Illumina 建库试剂盒进行文库构建，再经Qubit定量和文库检测合格后，在Illumina MiSeq 平台上进行双末端测序（诺禾致源生物信息科技公司，北京）。

Illumina Miseq 双末端测序结束后，根据Barcode序列将拆分下机数据，并截去Barcode 序列和PCR 扩增引物序列。将拆分的数据使用FLASH (V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样品的reads 进行拼接，得到有效序列。将有效序列进行去杂过滤掉，其中连续高质量碱基长度小于序列长度75%的序列，去除嵌合体，最终得到可用于后续分析的优质序列。使用Uparse 软件将相似性大于97%的序列聚为一个OTU。通过RDP 数据库对OTU 进行分类和物种注释，统计各个样品在不同水平（门、纲、目、科、属）的物种分类。本试验使用Shannon指数和Chao1指数来评定细菌群落的多样性和丰富度。Shannon指数代表微生物群落的多样性，Chao1 指数代表微生物群落的丰富度。通过层次聚类（Hierarchical clustering）中的非加权组平均法构建（Unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）进化树。所有参数使用在线Mothur软件制作(http://www.mothur.org)。

1.2.3 Real-time PCR分析

引物序列具体见表2[5]。

表2 荧光定量PCR引物

冰上配制反应体系，在罗氏Light Cycler® 96 PCR仪上进行检测。反应条件为：95 ℃、600 s；95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、10 s；45个循环。根据公式2-△△ct，其中-△△ct=-（待测组目的基因平均ct值-待测组内参基因平均ct 值）-（对照组目的基因平均ct 值-对照组内参基因平均ct 值），计算基因表达量的相对倍数。PCR 产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.2.4 统计分析

试验数据采用SAS9.2软件的PROC MIXED 模型进行方差分析，并用Tukey's法进行差异显著性比较，对于不同处理指标，在不服从正态分布时，做非参数检验重新分析显著性，P＜0.05代表差异显著。

2 结果

2.1 硝酸盐剂量对瘤胃细菌多样性指数的分析

本次测序共得到485 440条raw tags，经过处理后得到481 526条effective tags，平均每个样品含26 751条序列。以97%相似度作为阈值，共得到9 277个OTU，平均每个样品515 个OTU。由表3 可以看出，随着日粮硝酸钾剂量的增加，各组间的Shannon 指数和Chao1指数无显著差异。

2.2 硝酸盐剂量对瘤胃细菌群落的影响

表3 硝酸盐剂量对细菌Chao1指数和Shannon指数的影响

表4 硝酸盐剂量对瘤胃细菌相对丰度的影响（门水平）

由表4 可见，湖羊瘤胃内拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度总和占90%以上，说明这3 个细菌门在本试验的瘤胃细菌群落中为优势菌群。C和D组的拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度最高（P＜0.05），其它各菌门丰度在各组间无显著差异。

不同硝酸钾剂量的瘤胃细菌群落结构聚类结果（见图1）显示，不同硝酸盐剂量的瘤胃细菌区系分为三大类，C和D组之间具有很高的相似性，E和F组之间具有很高的相似性。A和B组相似。

为进一步探究瘤胃的菌群结构，选取属水平上丰度排名前35 的细菌绘制热图并聚类（见图2）。由图可知，C 和D 组的普雷沃氏菌属（Prevotella）相对丰度最高（P＜0.05），其它菌属丰度在各组间无显著差异。

图2 硝酸盐剂量对瘤胃细菌相对丰度的影响（属水平，前20）

为分析瘤胃细菌群落与发酵参数间的关系，以细菌群落在属水平上的相对丰度前20的数据为物种数据，瘤胃液中日粮硝酸盐添加量、亚硝态氮含量、pH值、氨态氮含量为变量，进行了Speraman 分析，见图3。由图可知，相对丰度前20 的瘤胃细菌属与日粮硝酸盐添加量之间无显著相关关系，甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）的相对丰度与亚硝态氮含量呈显著正相关（P=0.006，r=0.624 0）；瘤胃球菌属（Ruminococcus）（P=0.016，r=-0.560 4）与氨态氮含量呈显著负相关；梭状杆菌属（Clostridium）、菌属（Shuttleworthia）、粪球菌属（Coprococcus）、丁酸弧菌属（Butyrivibrio）、假丁酸弧菌属（Pseudobutyrivibrio）的相对丰度与瘤胃液pH 值呈显著正相关（P＜0.05，r=0.499 7-0.602 0），普雷沃氏菌属（Prevotella）的相对丰度与瘤胃液pH值呈显著负相关（P=0.028，r=-0.518 3）。

基于OTU 水平细菌群落与硝态氮还原产物进行RDA分析，结果见图4。有图可知，第1排和第2排序轴分别可解释细菌群落组成变异的36.1%和24.68%。瘤胃液pH 值与第一排序轴的关系较近（r=0.946 4），亚硝态氮残留量和氨态氮与第二排序轴的关系较近（r=0.472 3，0.596 3）。亚硝态氮残留量、瘤胃液氨态氮含量和pH值与日粮硝酸钾添加量呈正相关关系，瘤胃液氨态氮含量与瘤胃液pH 值呈负相关关系。未添加硝酸钾3个平行样本（A1、A2、A3）较集中，日粮添加18 g/d 和24 g/d 硝酸钾的3 个平行样本（D1、D2、D3；E1、E2、E3）较集中，且随着硝酸钾添加量的升高，个体动物的细菌区系离散程度增加，说明硝酸钾改变了瘤胃细菌区系，但存在个体差异。

2.3 硝酸盐剂量对瘤胃硝酸盐还原菌相对丰度的影响

挖掘高通量测序结果，未检测到有显著性差异的细菌种类，且相对丰度均较低。因此，本试验采用RT-PCR 方法进一步研究已报道的硝酸盐还原菌相对丰度的差别。由图5 可知，反刍兽新月单胞菌（S.ruminantium）的相对丰度在各硝酸盐剂量间无显著影响。相反，胎儿弯曲杆菌（C. fetus）的相对丰度随硝酸盐添加量的增加逐渐上升，F组最高（P＜0.01），D组和E组显著高于A组和B组（P＜0.01）。

3 讨论

硝酸盐可为瘤胃微生物提供氮源，并且经还原生成氨[1]。硝酸盐对瘤胃液氨态氮水平和pH 值的影响结果不一致。Zhao等[7]报道，占日粮2%的硝酸盐不影响瘤胃液氨态氮含量和pH 值，而不同研究表明添加硝酸盐可提高瘤胃液氨态氮水平和pH值[4，7]。本试验关联分析也发现硝酸盐添加量与氨态氮和pH值呈正相关关系，这与前人结果相似。有研究发现，在培养底物中加入5 mmol/l硝酸盐，Chao1指数和Shannon指数无显著差异[8]，刘丽慧等[9]体外研究表明，5 mmol/l 的硝酸钠不影响瘤胃细菌总数。本试验的结果表明，湖羊日粮硝酸钾剂量达30 g/d 时不影响瘤胃细菌群落的多样性和丰度。本试验通过16S rDNA测序对门水平湖羊瘤胃细菌群落结构研究发现，瘤胃中拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，与Perumbakkam等[10]的研究一致。Kim等[11]的研究同样证明了，这三个菌门构成了瘤胃的核心菌群。拟杆菌门大部分为革兰氏阴性菌，多数菌属有很高的多糖降解活性，拥有大量多糖分解酶基因[12-13]。Fernando 等[14]用16S rRNA 基因文库的方法研究肉牛瘤胃微生物发现，采食高精料日粮组，瘤胃中拟杆菌门所占比例显著升高，这与本试验选用较高精料比例日粮的结果相似。本试验中，拟杆菌门的相对丰度随日粮硝酸钾剂量的增加而先上升后下降，最高丰度时硝酸盐剂量为12 g/d 和18 g/d。可见，适当的硝酸钾剂量可增加拟杆菌门的相对丰度，但过高的日粮硝酸钾抑制拟杆菌门的增殖活动。

图3 瘤胃细菌相对丰度与发酵参数相关性分析（属水平）

普雷沃氏菌属为拟杆菌门内的优势菌属。Stevenson等[15]使用Real-time PCR的方法，对两头荷斯坦奶牛瘤胃液分析发现，普雷沃氏菌属的相对丰度为42%～60%。可见，该菌属是瘤胃中的常驻菌属，并且有很高的丰度。普雷沃氏菌属是拥有高活性的降解半纤维素的菌种[16]。与拟杆菌门相似，普雷沃氏菌属的相对丰度在日粮含有硝酸钾12 g/d 和18 g/d 时最高，并随着硝酸钾剂量的升高而下降，说明该菌属丰度受硝酸钾剂量的影响。关于普雷沃氏菌的相对丰度与pH值之间的关系报道不一致。林波等[17]报道全粗料日粮使普雷沃氏菌科的相对丰度显著升高，Zhao等[7]报道添加硝酸盐不改变肉牛瘤胃液普雷沃氏菌属相对丰度。本研究结果表明普雷沃氏菌属相对丰度与瘤胃液pH值呈显著负相关。不同的结果原因可能是硝酸盐的添加剂量及动物品种差异导致。厚壁菌门中以纤维分解菌为主[18]，本试验检测到的5 种与瘤胃液pH值呈显著相关的菌属均属于厚壁菌门。本试验中瘤胃球菌属相对丰度与瘤胃液硝酸盐添加量无显著相关关系，这与Wang 等[1]的研究结果一致；Patra等[19]研究也表明黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌相对丰度不受硝酸盐的影响。本试验丁酸弧菌属、梭状杆菌属、粪球菌属的相对丰度与pH 值呈显著正相关，但不受硝酸盐添加剂量的影响，这与Zhao 等[7]结果相似。

图4 瘤胃细菌相对丰度与硝态氮发酵参数相关性分析（属水平）

图5 不同硝酸盐添加量对反刍兽新月单胞菌和胎儿弯曲杆菌相对丰度的影响

反刍兽新月单胞菌是Iwamoto 等[3]研究提出的瘤胃还原硝酸盐的细菌（反刍兽新月单胞菌，小韦荣氏球菌和产琥珀酸沃廉菌）中起主要作用且数量最多的细菌。Asanuma等[4]证明该菌在硝酸盐还原过程中发挥着重要作用，且能够降解淀粉等可溶性碳水化合物。Yoshii 等[20]的研究表明，淀粉分解菌能增强反刍兽新月单胞菌还原硝酸盐的能力。本试验中小韦荣氏球菌和产琥珀酸沃廉菌并未出现在排名前20的属中，可能因为这两种菌在瘤胃内的含量极少。本试验通过Real-time PCR 可以看出，各组间反刍兽新月单胞菌的基因拷贝数并无显著差异，与16S rDNA 高通量测序结果一致。胎儿弯曲杆菌在瘤胃内的总量很少[5,7]，且多报道为病原菌[21]。但该菌可随硝酸盐添加量的升高而升高，并具有潜在的还原硝酸盐和亚硝酸盐的能力[5]。这与本试验结果一致。尽管本研究前期结果表明动物血液中的高铁血红蛋白含量随硝酸盐添加量的增加而升高，但未出现中毒症状[22]，由于胎儿弯曲杆菌的病原性，本试验推测过高剂量的硝酸盐对瘤胃细菌正常区系有一定的危害。

4 结论

本试验研究了不同日粮硝酸钾剂量对湖羊瘤胃细菌群落结构的影响，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是优势菌群。日粮含12 g/d和18 g/d的硝酸钾增加了湖羊瘤胃拟杆菌门、普雷沃氏菌属和胎儿弯曲杆菌的相对丰度，但过高的硝酸钾抑制优势菌群的增殖。