利用体外培养法研究奶牛瘤胃中奇链支链脂肪酸与微生物菌群的相关性

刘 鑫,么恩悦,郑 健,辛杭书,张永根 (东北农业大学 动物科学技术学院,黑龙江 哈尔滨150030)

瘤胃作为反刍动物消化道独特的部分,是反刍动物营养研究的重点。瘤胃内富含的微生物菌群同瘤胃密闭、厌氧的特点使其成为一个天然的发酵罐,适宜的微生物区系结构维持着瘤胃内环境的平衡。目前实时荧光定量PCR 已经广泛应用于瘤胃纤维分解菌和淀粉分解菌的研究,但此方法操作复杂且成本较高；因此,有必要寻找一种简单易行且对动物无损害的方法来观测微生物的变化。

奇链支链脂肪酸(odd-and branched-chain fatty acids,OBCFA)主要来源于瘤胃细菌,而且内源合成的量十分有限[1]。而在瘤胃微生态体系中,不同的微生物种类中所含的OBCFA 含量也不尽相同,OBCFA 与饲料组成和细菌生长速率关系密切,可以用OBCFA 来评估瘤胃微生物种群组成和变化[2],并作为评估瘤胃细菌营养供应的工具[3]。RAN-RESSLER 等[4]对大量的研究文献进行汇总得知,纤维分解菌属含有较高含量的支链脂肪酸,如黄色瘤胃球菌含有较高含量的奇支链脂肪酸,白色瘤胃球菌含有较高含量的偶支链脂肪酸,而普雷沃氏菌属中的含量比较丰富。相比之下,淀粉分解菌属(溶糊精琥珀弧菌,溶淀粉琥珀酸单胞菌,嗜淀粉瘤胃杆菌,反刍兽新月形单胞菌和牛链球菌等)中的支链脂肪酸水平较低,但奇数碳直链脂肪酸的含量较为丰富。RUTKOWSKA 等[5]表明,纤维分解细菌的活动动态受日粮变化的影响很大。而乳中OBCFA 的变化也会受日粮因素(精粗比、粗饲料类型、添加脂肪类型以及营养水平等)影响。iso C14 和iso C15含量随着日粮中粗饲料比例的升高而增加[6]；当用玉米青贮饲料替代干草青贮饲料时,iso C14和iso C15 含量减少[4],而iso C17 和anteiso C17水平增加[7]；日粮添加鱼油或海藻油能够改变瘤胃的发酵特点,促进瘤胃产生丙酸,提高乳脂中线性奇数脂肪酸的比例[8]；乳脂中iso C14,iso C15和iso C16的含量会随着日粮中淀粉和中性洗涤纤维的含量而改变。另外,降低日粮粗蛋白质的含量,乳脂中的OBCFA 含量也随着降低,且与乳脂中的anteiso C17含量呈强的负相关[4]。然而以上均以天然存在的饲料原料为对象来研究乳脂中OBCFA,对纯碳水化合物与瘤胃中OBCFA 关系的研究鲜有报道。因此本试验以不同比例的纤维素和淀粉为体外发酵底物,探究碳水化合物结构对OBCFA 和瘤胃菌群的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂本试验所用的纤维素(S804601)、淀粉(S818265)和内标十九烷酸购自上海麦克林生化科技有限公司；外标细菌甲酯(BAME)和反异构十七烷酸(anteiso C17)分别购自Sigma和Larodan公司。

1.2 供体动物及瘤胃液采集选取3头体况良好、体质量相近、安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体。奶牛每天分别于7：30和19：30饲喂2次全混合日粮,自由饮水。日粮组成及营养水平见表1。晨饲前2 h分别采集3头奶牛的瘤胃液(每头采集500 m L),混合均匀后立即放入事先39℃预热并通入二氧化碳(CO2)置换出瓶中空气的保温瓶内,用瓶塞盖严瓶口,迅速运回实验室。

1.3 试验设计试验采用双因素试验设计,按培养底物中纤维素(F)与淀粉(S)比例设为5个处理,即F∶S ＝0∶100,25∶75,50∶50,75∶25,100∶0,每个处理3个重复,进行体外发酵试验。

表1 基础日粮组成与营养水平 %

1.4 体外发酵缓冲液参照FIEVEZ 等[9]方法配制,由常量元素溶液、微量元素溶液、缓冲液、还原剂溶液和刃天青溶液组成。使用前向配制好的缓冲液底部不断通入CO2,并在39℃预热,直至溶液颜色由粉色变至无色。随后将收集的瘤胃液用4层纱布过滤,并按瘤胃液∶缓冲液以1∶2的比例混匀,配制制人工瘤胃液。39℃恒温水浴,用磁力搅拌器不断搅拌,同时不断通入CO2以保证厌氧环境。

准确称取1 g底物置入厌氧发酵管(150 m L)的底部,保证饲料样品不接触管壁,使用分液器向培养管中加入人工瘤胃液100 m L,通入CO2(排出上部空气),随后迅速插入带有单向阀的胶塞(仅能排气,外部空气不能进入以保持其厌氧环境),缠绕封口膜(保证环境密闭)于39℃的恒温水浴摇床中培养。

1.5 样品采集和指标测定于体外发酵6,12,18,24 h后取出发酵瓶置于冰水中停止培育,每瓶各取2 m L发酵液于液氮中保存,用于微生物菌群的测定。剩余发酵液通过真空冷冻干燥机进行冻干,用于OBCFA 含量的测定。

1.5.1 发酵液OBCFA 的测定 脂肪酸的提取和甲基化基于GERVAIS等[10]描述的方法并加以改进。准确称量冻干样品200 mg到15 m L离心管中。向每个管中加入1 m L含有内标的苯(2 g/L十九烷酸溶于苯),1 m L 苯和3 m L 5%盐酸甲醇(10 m L 乙酰氯逐滴加入100 m L 甲醇中)。70℃水浴2 h后,冷却至室温,并加入5 m L 6% K2CO3和2 m L 苯。中速漩涡30 s后于1 500 r/min离心5 min,并将上部有机相转移至5 m L EP 管中。向培养管中的苯提取物中加入1 g无水硫酸钠,再次涡旋30 s并静置1 h。培养管于1 500 r/min离心5 min,并将含有甲酯的上层转移到培养管中,用N2吹至近干,重新溶于1 m L苯中,所得溶液利用气相色谱仪(岛津GC-2010)测定OBCFA 含量。

气相色谱测定条件：使用EquityTM-1气相色谱柱(15 m ×0.1 mm ×0.1μm)；分析条件：分流比为200∶1,进样口和检测器保持在280℃。升温程序从175℃开始,以15℃/min 增加至275℃,保持1 min来分离脂肪酸甲酯。气流：载气氮气,45 cm/s；氢气：40 m L/min；空气：400 m L/min。通过将它们的保留时间与外标的保留时间进行比较来鉴定脂肪酸甲酯,并通过内标进行计算。计算公式：目标脂肪酸(g/kg)＝[目标脂肪酸峰面积/内标峰面积]×[2(mg)/样品质量(g)]

1.5.2 发酵液中微生物菌群相对丰度的测定 发酵液总DNA 的提取采用珠磨－十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[11]。利用紫外分光光度计测定DNA 浓度和纯度,确保DNA 的D260nm与D280nm比值在1.6～1.8。利用实时荧光定量PCR (RTqPCR)技术检测微生物的相对数量,所用仪器为ABI7500型PCR 仪。RT-qPCR 的反应条件及体系组成参照SYBR Premix Ex TaqTM试剂建立10μL的反应体系。反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性5 s,50～55℃退火30 s,72℃延伸40 s,35个循环。所用引物序列(表2)由上海生工生物工程有限公司合成。

目标细菌相对数量表示为该菌相对于瘤胃总细菌16S r DNA 的百分比：目标细菌相对数量(%)＝[2－(Ct目标细菌－Ct总细菌)]×100。式中：Ct目标细菌为目标细菌的循环阈值；Ct总细菌为总细菌的循环阈值。

1.6 统计分析Excel进行数据整理。采用SAS 9.2软件包中的MIXED 模型对细菌相对种群丰度和OBCFA 含量进行统计分析,各平均数之间用Duncan’s法进行多重比较,结果用平均值和标准误的形式表示,其中P＜0.05代表差异显著。

2 结果

表3显示了不同F∶S发酵液中OBCFA 含量的结果。从中可以发现各OBCFA 含量在不同发酵时间和F∶S下均存在显著性差异(P＜0.05)。其中具有奇数碳原子的直链脂肪酸占总OBCFA 的比例最大,其次为异构脂肪酸,且C15 及其异构体所占的比例大于C17 及其异构体的比例。并且,各OBCFA 含量随发酵时间延长总体上呈上升趋势。发 酵24 h 时,iso C15,anteiso C15 和C17 含 量 在F∶S＝75∶25 组较高；F∶S＝50∶50 组anteiso C17含量高于其他组；而F∶S＝0∶100组iso C17和总OBCFA 含量最高。值得注意的是,isoC16含量始终是F∶S＝0∶100最高,F∶S＝0∶100组最低。此外,不同F∶S和发酵时间除对iso C17含量没有互作效应(P＞0.05)外,对其他OBCFA 含量均具有明显的互作效应(P＜0.05)。

表2 实时荧光定量PCR 引物序列

由表4可知,白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、溶纤维丁酸弧菌、嗜淀粉瘤胃杆菌和牛链球菌相对丰度受纤维素与淀粉比例以及发酵时间的影响(P＜0.05)。其中溶纤维丁酸弧菌和嗜淀粉瘤胃杆菌种群数量显著高于其他细菌。发酵24 h时,白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和溶纤维丁酸弧菌在F∶S＝100∶0 组的种群数量最高；牛链球菌在F∶S＝25∶75组种群数量最高；而嗜淀粉瘤胃杆菌种群数量在F∶S＝50∶50组最高。此外,除反刍兽新月单胞菌外,其他菌群的相对丰度受不同F∶S和发酵时间互作效应的影响(P＞0.05)。

由表5可知,白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的种群数量与iso C15和C15含量正相关(r＝0.25～0.70,P＜0.05),与iso C16 和anteiso C17 负 相 关(r＝－0.28 ～－0.38,P＜0.05)；而嗜淀粉瘤胃杆菌与iso C15 和C15 含 量 负 相 关(r＝－0.26 ～－0.43,P＜0.05),与iso C16和anteiso C17正相关(r＝－0.26～0.35,P＜0.05)；溶纤维丁酸弧菌的种群数量与iso C15、anteiso C15、iso C16、iso C17、anteiso C17和C17 呈负相关(r＝－0.35 ～－0.57,P＜0.05),与C15含量趋于负相关(r＝－0.26,P＝0.05)；而牛链球菌与iso C15、anteiso C15、iso C16、iso C17、anteiso C17 和C17 呈正相关(r＝0.34～0.43,P＜0.05),与C15含量没有相关关系；反刍兽新月单胞菌与C15含量正相关(r＝0.31,P＜0.05),与anteiso C17负相关(r＝－0.26,P＜0.05)。

3 讨论

日粮精粗比能够影响瘤胃OBCFA 含量,BAS等[15]研究结果表明,粗饲料水平或NDF 含量可以改变瘤胃细菌脂肪酸的含量和组成。本试验中高纤维水平组发酵6,12 h,iso C15、anteiso C15、iso C16和iso C17含量显著高于其他组。ZHANG 等[13]等发现F∶C为70∶30的iso C15、iso C16和iso C17含量显著高于其他精粗比。表明高水平粗料有利于瘤胃细菌中支链脂肪酸的合成。这些脂肪酸可以在氢转移中起作用,为宿主动物节约能量[15]。此外,TAJIMA 等[16]发现当日粮粗纤维比例提高时,瘤胃液相和固相细菌中的iso C15都提高了。而本试验中发酵时间为12,18 h时,纤维素和淀粉比例为75∶25组的C15 及其异构体含量显著高于其他组。在体外研究中,饲料经过21 h消化后发现较高的淀粉含量导致合成的C17量增加[17],与本试验结果相似,而较高含量的中性洗涤纤维(NDF)与anteiso C15的含量呈正相关[17]。

瘤胃微生物主要由细菌、真菌和原虫组成,其中细菌的种类和数量繁多,占微生物总量的比重最大。微生物之间相互依赖,同时又相互制约,这种平衡的建立能够维持瘤胃内环境的稳定,所以微生物区系的研究至关重要。通过调控瘤胃微生物区系结构,能够增强反刍动物对饲料的利用,可提高反刍动物

表3 碳水化合物结构对奶牛瘤胃OBEFA 含量的影响 g/kg

表4 碳水化合物结构对瘤胃细菌相对种群数量的影响

续表4

表5 瘤胃OBCFA 含量与瘤胃细菌相对种群数量的相互关系

的生产性能。瘤胃微生物区系变化受诸多因素的影响,其中最主要的因素来源于日粮结构。KOIKE等[18]指出瘤胃细菌的变化与日粮的组成和在瘤胃中的转移有很大的相关性。在本试验中,白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌在纯纤维组的种群数量最高；牛链球菌在高比例淀粉组种群数量最高；嗜淀粉瘤胃杆菌种群数量在F∶S＝50∶50组最高,这与它们的分解底物有关。刘烨彤等[19]研究饲喂不同精料比例的日粮对纤维分解菌和淀粉分解菌的影响,结果显示,随精料比例的升高,淀粉分解菌数量极显著增加,纤维分解菌的含量随精料比例上升呈下降趋势。黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌主要以纤维素和半纤维素为主要分解底物产生乙酸、丁酸、H2和CO2；而嗜淀粉瘤胃杆菌、反刍兽新月形单胞菌和牛链球菌等分解淀粉或糖类、蛋白和肽类物质产生乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、H2和CO2。本试验中溶纤维丁酸弧菌种群数量并没有随着纤维素含量的增加而显著提高,可能是由于这类菌能够同时利用纤维素和淀粉的结果[20]。

瘤胃固相(SAB)和瘤胃液相(LAB)在化学成分[21]和酶活性[22]之间的差异表明细菌物种的分布在液体和固体相中是不同的。增加F∶C 比率通常有利于瘤胃固相,因为更多的纤维分解细菌附着在饲料颗粒上[23],而瘤胃液相富含淀粉分解细菌。FIEVEZ等[24]认为瘤胃OBCFA 组成的变化能够反映瘤胃细菌相对丰度的变化。基于之前瘤胃细菌OBCFA 种类分析,纤维素降解菌的升高能够导致异构脂肪酸的比例提高,而淀粉分解菌升高可提高反式异构和线性奇数链脂肪酸的比例。然而,我们的结果与体内试验获得的数据不完全一致,可能是由于瘤胃中不同细菌变种和复杂环境之间存在相互作用[25],而体外试验不能完全模拟体内环境。本试验发现白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌与iso C15存在显著的相关性,而与iso C17没有显著的相关关系,可能是iso C15和iso C17在细菌中的合成路径相似,因此两者之间存在竞争底物的可能性。瘤胃内奇数链脂肪酸(C15：0和C17：0)通过丙酸盐或戊酸盐的延长形成,而淀粉分解菌分解淀粉等产生的丙酸可作为合成前体。本试验中反刍兽新月单胞菌和牛链球菌分别与C15：0和C17：0含量相关,也验证了这一结论。此外,研究表明溶纤维丁酸弧菌是异质性的细菌种群,含有的不同菌株能够发酵多种底物[10],如纤维和淀粉,还能发酵脂肪酸,并产生大量的乙酸和乳酸,而这些产物又能反过来促进其生长[26]。而 本 试 验iso C15、anteiso C15、C15、iso C16、iso C17、anteiso C17 和C17 均 与 溶 纤 维 丁 酸弧菌存在相关关系。

综上所述,碳水化合物结构能够影响瘤胃菌群丰度以及OBCFA 的含量。iso C15、C15和iso C16能够反映纤维分解菌的菌群变化,而anteiso C17能够评估淀粉分解菌的菌群丰度。