菊苣酸(CA)对LPS诱导的牦牛PBMC细胞炎性因子分泌及表达的影响

阿顺贤,张元新,王爱超,张文颖,武 强,薛才华,吴 华∗ (.青海大学 农牧学院,青海 西宁8006；.青海大通种牛场,青海 西宁800)

近年来,紫锥菊及其制剂作为一种免疫调节剂在国际上备受关注。研究发现,紫锥菊中含有烷基酰胺类、不饱和酮类、咖啡酸衍生物、倍半萜类和生物碱类等化合物[1]。菊苣酸(chioric acid,CA)属于咖啡酸衍生物,具有增强免疫功能、抗炎的作用,并能抑制透明质酸酶,保护胶原蛋白Ⅲ免受可导致降解的自由基的影响[2]。炎症是机体对感染、组织损伤及伤害性刺激等做出的保护性反应[3]。炎症伴随着很多疾病的发生和发展,同时又会加重疾病的发展。脂多糖(lipopolysaccheride,LPS)是革兰阴性菌细胞壁的主要成分,也是革兰阴性菌的主要致病物质,可参与诱导细胞损伤,加重炎症[4]。本课题组在CA 对牦牛低氧适应性和免疫功能研究基础上,为进一步明确CA 的抗炎作用及其机制,以LPS刺激的牦牛外周血单个核细胞(PBMC)为炎症模型,观察CA 对炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、白 细 胞 介 素-1β(IL-1β)、干 扰 素-γ(INF-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-10(IL-10)的影响,同时探讨CA 的抗炎作用,旨在细胞转录组水平上探讨CA 的抗炎活性,期待为CA的深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物试验动物来源于青海大通种牛场提供的4头6～7岁牦牛。

1.2 试验试剂LPS购自索莱宝生物科技有限公司；刀豆蛋白A (concanavalin A,Con A)和CA 购自SIGMA 公司；RPMI-1640 培养基和双抗购自GIBCO 公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司产品(TBD)；胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；CCK-8试剂盒购自江苏省海门碧云天生物技术研究所；牛IL-6试剂盒、牛IL-8试剂盒、牛IL-10试剂盒、牛IL-1β试剂盒、牛TNF-a试剂盒、牛INF-γ试剂盒均购自上海鑫乐宝生物科技有限公司；SYBR GreenⅡ荧光定量PCR 试剂盒、反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司产品。

1.3 试验仪器净化工作台,购自江苏通净净化设备有限公司；CO2恒温培养箱,MU-5810E,购自美国NUAIRE公司；水平离心机,V18R,购自英国Dynamica公司；酶标仪,Power Wave XS2 Bio Te KR,购自Gene Company Ltd.USA；电泳仪和荧光定量PCR 仪器,购自美国Bio-Rad公司。

1.4 试剂配制

1.4.1 CA 溶液的配制 将0.18 g的CA 溶于1 m L的二甲基亚砜(DMSO)中(CA 产品加入到DMSO中以除去紫锥菊提取物中LPS的影响),然后溶于4.88 m L的培养基中(母溶液),－20℃保存,使用前稀释成相应质量浓度。

1.4.2 LPS溶液配制 将0.1 mg LPS粉末溶解于1μL双蒸水,母液质量浓度为0.1 g/m L,分装后保存于－80℃冰箱,使用前稀释成相应质量浓度。

1.5 牦牛PBMC分离清晨空腹从4头牦牛的静脉分别采集30 m L血液装于肝素钠抗凝管中,将样本装入便携式冰箱,尽快送达试验室进行分析。0.5 h 紫外光照射消毒超净工作台,无菌条件下,将外周血标本与等量稀释液充分混匀。另取一支50 m L 离心管,加入与稀释后样本等量的分离液。将离心管倾斜45°,稀释后的血液从分离液液面上方约1 cm 处沿管壁缓慢加至分离液面之上,2溶液要形成明显的界限(尽快加完样本,防止时间过长,红细胞沉淀进入分离液,影响分离效果)。18～20℃、450 r/min水平离心45 min。使得血液各成份分层,中间白膜层为PBMC层。巴氏管小心吸取白膜层,移入另一支无菌离心管中。往该离心管中加入至少于PBMC 3～4 倍体积的清洗液,震荡混匀,4℃、300 r/min离心15 min,弃去上清液,保留管底沉淀,重复该步骤2～3次。用1 m L 双蒸水洗涤稀释沉淀,用加样枪头吹打混匀,然后加20 m L 清洗液,4℃300 r/min离心15 min。弃上清后,会发现PBMC黏附在管底,可用1 m L完全1640培养液重悬所得细胞,混匀。PBMC 计数：取0.1 m L 悬液,0.8 m L 淋巴细胞稀释液和0.1 m L 0.4%台盼蓝染液,混匀,室温静置2～3 min。细胞计数板计数显微镜下4个大方格的细胞总数A。按照以下公式计算：实际细胞数＝A/4×10×1 000×稀释倍数。

1.6 CCK-8法测定细胞活力将PBMC 细胞计数后,按每孔3×104个接种于96孔板(100μL)中,分组：空白组,对照组,CA 组,LPS 组,CA＋LPS 组,调整LPS 的终质量浓度分别为0.1,1.0,5.0,10.0 mg/L,CA 用60.0 mg/L。每组设3个复孔,然后置于37.5℃5%CO2培育箱培养48 h。

从CO2培育箱中取出细胞培养板,每孔加入10μL CCK-8 溶液,继续培养6 h,用酶标仪测定D450nm值。计算各组细胞存活率。细胞存活率＝(D试验组－D空白组)/(D对照组－D空白组)×100%。

1.7 ELISA法测定牦牛PBMC 炎性相关因子含量

细胞计数后,按每孔3×104个接种于96 孔板(100μL)中,分为4组：对照组,CA 组,LPS组,CA＋LPS组,调整LPS的终质量浓度为1.0 mg/L,CA用60.0 mg/L。每组设3个复孔,然后置于37.5℃5%CO2培育箱培养48 h。

通过ELISA 法,采用上海鑫乐宝生物科技有限公司的牛IL-6试剂盒、牛IL-8试剂盒、牛IL-10试剂盒、牛IL-1β试剂盒、牛TNF-a试剂盒和牛INF-γ试剂盒,按试剂盒说明书用酶标仪进行相关因子D值的测定。

1.8 实时荧光定量PCR法检测牦牛PBMC炎性相关因子mRNA表达按1.7所述分组,采用细胞培养瓶进行牦牛PBMC分组培养。

1.8.1 提取总RNA 用PBS溶液洗涤培养48 h后取出的细胞,注入1 m L RNAiso plus,反复吹打至无明显沉淀；将液体转移至EP 管中,加入200μL氯仿,盖紧管盖,剧烈振荡15 s；4℃条件下12 000 r/min离心15 min；取出离心管后转移上清液,向离心管内添加500μL 异丙醇,颠倒混匀,沉淀RNA,室温放置10 min；4℃,12 000 r/min的条件下离心10 min；弃去上清,将1 m L 75%乙醇沿管壁缓缓添加进离心管。上下颠倒洗涤管壁,4℃,12 000 r/min离心5 min；弃去乙醇,将沉淀在室温下干燥2～3 min,然后加入20～30μL 的无RNase的水溶解RNA 沉淀,沉淀完全溶解后,将其储存在－80℃的冰箱中。

量取40 m L 的5×TAE 电泳缓冲液并称量0.40 g 琼脂糖以制备琼脂糖凝胶,微波炉加热2 min,加入1μL Goldview 混匀,在电泳室中加缓冲液,液面覆盖凝胶即可。每4μL 总RNA 样品与1μL上样缓冲液混合,依次加入到凝胶上的电泳孔中,并在120 V 下电泳15～20 min,凝胶成像仪下观察RNA 条带的分布。

1.8.2 反转录c DNA 采用天根生化科技有限公司DNA 第一链合成预混试剂盒进行逆转录反应：5×Fast King-RT Super Mix 4.0 μL,Total RNA 100 ng,用RNase Free dd H2O 补足到20μL。反应程序为42℃15 min,95℃3 min；产物cDNA 模板置于－20℃冰箱。

1.8.3 Q-PCR 引物的设计及合成 引物由上海生工设计合成(表1)。

1.8.4 实时荧光定量PCR 建立real-time PCR 反应体系(表2),盖上反应管,轻柔混匀。反应程序：95℃15 min；95℃10 s,55℃30 s,72℃32 s,40个循环。

1.9 数据处理数据通过Excel统计,最终采用SPSS 22.0应用ANOVA 进行分析,各项指标以±s,采用Origin Pro 8.5做出柱状图,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著,P＞0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 CCK-8法测定细胞存活率从表1可以发现,与对照组相比,0.1,5.0,10.0 mg/L 的LPS处理和LPS＋CA 处理均极显著降低了细胞存活率(P＜0.01),1.0 mg/L的LPS处理显著降低了细胞存活率(P＜0.05)；在不同质量浓度的LPS单独处理组中,1.00 mg/L 的LPS 处理,细胞存活率显著高于其他质量浓度处理组(P＜0.05)；在不同质量浓度的LPS＋CA 共同处理组中,1.0 mg/L的LPS＋CA处理,细胞存活率显著高于其他LPS质量浓度处理组(P＜0.05)。

表1 引物序列

表2 real-time PCR 反应体系

2.2 CA对牦牛PBMC炎性相关因子含量的影响

由图1可见,与对照组相比,CA 处理组降低IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-a和INF-γ的含量,但差异不显著(P＞0.05),IL-10的含量显著增加(P＜0.05)；LPS处理组显著提高IL-6和IL-1β的含量(P＜0.05),极 显 著 提 高IL-8、TNF-a 和INF-γ 的 含 量(P＜0.01)。与CA 处理组相比,LPS处理组极显著增加IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-a 和INF-γ 的 含 量(P＜0.05),但IL-10 的 含 量 显 著 减 少(P＜0.05)。与LPS处理组相比,CA＋LPS 处理组IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-a和INF-γ的含量均显著降低(P＜0.05),但IL-10的含量显著升高(P＜0.05)。

表1 CA 对LPS诱导的牦牛PBMC存活率的影响

2.3 CA对牦牛PBMC 炎性相关因子mRNA 表达的影响利用比较阈值法(2－ΔΔCt)进行相对定量,循环次数为细胞在PCR 中的扩增反应的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数。以对照组的牦牛PBMC作为对照,将其设为1 进行阈值比较,后根据公式：2－ΔΔCt＝2－[试验组ΔCt－对照组ΔCt]计算得出下列结果。

由图2可见,与对照组相比,CA 处理组显著降低IL-1βmRNA 表达(P＜0.05),显著升高IL-10 m RNA 表达(P＜0.05)；LPS处理组极显著升高IL-6、IL-8、IL-1β、INF-γ 和TNF-α m RNA 表 达(P＜0.01)；CA＋LPS处理组IL-6、INF-γ和IL-10 mRNA 表达显著升高(P＜0.05),TNF-αm RNA 表达极显著升高(P＜0.01)。与CA 处理组相比,LPS处理组IL-6、IL-8、IL-1β、INF-γ和TNF-α m RNA 表达均极显著升高(P＜0.01)；IL-10 m RNA 表达显著降低(P＜0.05)；CA＋LPS 处理组IL-6、TNF-α m RNA 表达极显著升高(P＜0.01),INF-γ和IL-10 m RNA 表达显著升高(P＜0.05)。与LPS处理组相比,CA＋LPS处理组IL-6、INF-γ和TNF-αm RNA 表达显著降低(P＜0.05),IL-8和IL-1βm RNA表达极显著降低(P＜0.01),IL-10 m RNA 表达显著升高(P＜0.05)。

图1 CA 对牦牛PBMC炎性相关因子含量的影响 注：∗表示差异显著(P＜0.05)；∗∗表示差异极显著(P＜0.01)。下同

3 讨论

CA 是紫锥菊的咖啡酸类衍生物,具有免疫调节,抗氧化,抗病毒,抗炎,调节细胞凋亡等作用。外周血单个核细胞(PBMC)是免疫效应细胞,在机体的免疫系统中起着非常重要的作用,也是体内启动炎症介质产生的中心细胞。LPS是革兰阴性菌细胞壁外膜的主要组成成分,也是引起炎症反应的关键细胞毒性因子。炎症模型是一个经典模型,当细胞受到炎症刺激因子如LPS诱导刺激后,LPS与细胞表面受体蛋白发生特异性结合,促进细胞释放IFNγ、L-1β、TNF-α、IFN-γ 和IL-6 等多种炎性因子参加炎症反应[5],过量的炎性因子甚至会导致严重的系统性并发症,而这些炎性因子是检测炎症严重程度的量化指标[6]。

IL-6作为一种多效能因子,是发热和急性炎症反应的最重要介质之一,能够穿越血脑屏障和启动下丘脑中的前列腺素合成从而改变人体的温度设定点,还可通过作用于特定的PAMPs病原相关分子模式并绑定到模式识别受体上,从而诱导细胞内的信号转导通路而产生其他炎性细胞因子[7]。IL-8作为一种典型促炎因子,可激活单核细胞[8]。IL-1β是最早参与炎性反应的主要内源性介质,可作为判断早期炎症发生的标准[9]。IFN-γ 可抑制IL-1β、IL-23、骨桥蛋白的表达,同时诱导DCs 细胞产生抗炎细胞因子IL-27,抑制IL-17 产生的局部炎性反应[10]。TNF-α是一个经典的炎症指标,具有诱导多种炎症因子产生,最终导致细胞凋亡的作用,处于炎症级联反应的中心环节,其表达量的多少可以直接反映炎症的严重程度[11]。本试验发现,所使用的60.0 mg/L 的CA 溶液可以显著减少LPS诱导的牦牛PBMC 中IL-6、IL-8 及TNF-a 的 分 泌(P＜0.05),显著降低LPS 诱导的牦牛PBMC 中IL-6、INF-γ和TNF-αm RNA 表达(P＜0.05),极显著降低LPS诱导的牦牛PBMC中IL-8和IL-1βm RNA表达(P＜0.01)。IL-10是一种多效能抗炎因子,它可抑制趋化因子、炎性因子介导的平滑肌细胞增殖效应,还具有抑制黏附分子表达、防止心肌缺血、降低再灌注损伤等心肌保护作用[12]。在本试验中,60.0 mg/L 的CA 溶 液 可 以 显 著 升 高IL-10 的 含量,显著升高LPS诱导的牦牛PBMC中IL-10 m RNA 表达。

图2 CA 对LPS诱导的牦牛PBMC炎性相关因子mRNA 表达的影响

综上所述,CA 可以抑制LPS诱导的牦牛PBMC炎症反应,其抗炎作用与抑制细胞促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β、INF-γ和TNF-α生成与表达,促进细胞抗炎因子IL-10的生成与表达有关。